不要看数量，要看质量

前面我们组建了：免费视频课程《RNA-seq数据分析》交流群 ，很多人马上学习了全套实战视频，并且实践了一个转录组项目流程，新手问的最多的问题是：为什么我给的RNA-seq表达矩阵代码需要的是counts格式输入，而且使用3个不同的R包做差异分析，这3个R包该分别如何设置阈值来进行统计学显著的差异表达基因筛选，以及多个R包数量有时候差异很大，该如何取舍。

我的回答，统一是：不要看数量，要看质量！！！

早在教程：RNA芯片和测序技术的比较（学徒作业）,我其实就提出来了，比较同样实验设计的两个表达量探索研究，一个研究使用的是芯片，一个是测序，看看两者的差异基因情况的overlap情况，这样的策略其实是太粗糙了。正确的做法应该是看两次差异分析的基因的logFC的散点图，如下：

两次差异分析的基因的logFC的散点图

而且你可以进行更细致的探索，我们这里以文章：《RNA sequencing atopic dermatitis transcriptome profiling provides insights into novel disease mechanisms with potential therapeutic implications》为例子：

比如把基因按照表达量划分高中低三组，后再去看表达量相关性：

表达量分组后看相关性

再比如选取那些两次差异不统一的基因进行后续功能富集，看看那些基因是否有很多生物学意义。

结果不稳定的基因的注释

这样的探索才是合格的，首先要搞清楚流程，然后搞清楚流程里面的哪些细节是可以调整的， 而且理解调整前后的结果的变化的差异程度能够被接受与否。

以及如何论证不同流程，不同软件，不同参数，不同阈值的结果的差异背后的生物学意义。多做一些实战项目是有助于你理解差异分析的作用和本质