还不会研究热门通路？这篇文章带你入门

今天和大家分享的是2020年1月发表在Aging（IF=4.831）上的一篇文章：“Prognostic value of a hypoxia-related microRNA signature in patients with colorectal cancer”，作者利用高通量筛选（HTS）得到了具有显著预后价值的4个miRNA，并基于它们构建了一个风险评分模型。在验证其独立预后价值之后，作者又将miRNA模型与其他结直肠癌（CRC）临床预后影响因素相结合，提供了一个准确便捷的CRC临床预后方法。

Prognostic value of a hypoxia-related microRNA signature in patients with colorectal cancer

缺氧相关的miRNA标志物在结直肠癌中的预后价值

一、研究背景

CRC一种死亡率很高的恶性肿瘤，主要归因于其高复发率和诊断不及时，而目前除癌症的病理分期之外，CRC并没有很稳定的预后标志物。有研究表明缺氧与CRC的不良预后有关，而本文作者的课题组曾报道过缺氧诱导的miR-210是一个独立的CRC预后因素，故作者希望基于缺氧相关的miRNA表达谱，找出可以作为CRC独立预后因素的miRNA标志物。

二、分析流程

三、结果解读

1、筛选在缺氧环境下高表达的miRNA

首先，作者在表1中给出了本文中使用的一个训练集和两个验证集的基线资料表

• 作者在常氧和低氧条件下培养了CRC细胞株（HT-29）48小时，之后对这些细胞进行高通量测序（HTS），以表达量上调至少1.5倍作为差异表达的标准，共筛选到52个有表达差异的miRNA（结果如补表1所示），作为miRNA标志物的候选队列。

表1.本文使用数据集的基线资料表

补表1.HTS筛选出的有差异表达的miRNA（部分结果）

2、筛选出有预后价值的miRNA

为了在以上52个miRNA候选队列中筛选出有CRC预后价值的miRNA，作者先后进行单因素、多因素cox回归分析来判断它们的预后影响和独立性。

• 补表2：对52个miRNA做单因素cox，得到8个与预后相关的miRNA（P值<0.1)
• 补表3：对8个有预后价值的miRNA做多因素cox，得到4个对CRC预后影响有独立性的miRNA，其中miR-197、miR-210、miR-26a的HR大于1，会导致CRC的不良预后；而miR-375的HR小于1，与较良好的CRC预后有关。
• 补图1：作者对得到的4个miRNA进行KEGG信号通路分析，给出了富集程度最高的20个通路

补表2.单因素cox中p<0.1的8个miRNA

补表3.多因素cox中对预后影响有独立性的4个miRNA

补图1.KEGG信号通路分析结果

3、miRNA标志物的构建和预测能力评估

作者根据上述多因素cox结果，基于4个miRNA的系数构建了一个风险评分公式：(0.2113*miR-210) + (0.4688miR-26a) + (0.4337miR-197) + (-0.2266miR-375)，接下来作者对这个4个miRNA构成的预后标志物的预测能力进行检测。

• 首先，作者利用X-tile软件对训练集患者的高/低风险分组取cut-off。如补图2结果所示，风险评分的cut-off取1.6，将训练集患者分为高风险组（n=59）和低风险组（n=322）

补图2.X-tile取cut-off的结果图

• 图2-A、B：给出了风险评分对应患者生存的关系，发现高风险组患者的生存时间更短 图2-C：绘制了4中miRNA在高/低风险患者中的表达模式，发现miR-197、miR-210、miR-26a在高风险组高表达，而miR-375在低风险组高表达，与先前结论符合。 图2-D、E：作者对高、低风险组进行KM生存分析并做ROC曲线，发现低风险组患者的中位OS明显更高，且3年5年的AUC值均大于0.7，表明该miRNA标志物具有良好的CRC预后预测价值。

图2.用训练集样本评估模型预测价值

4、验证miRNA标志物预后价值

• 在图三中，作者分别对TCGA验证集（n=190），TCGA总集（n=571）、FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织验证集（n=220）进行KM生存分析和绘制ROC曲线，获得了与上述在训练集中得到的一致结论：高风险组患者预后更差，且此miRNA预后标志物的预测能力良好

图3.3个验证队列的KM生存分析与ROC曲线

5、miRNA标志物对预后影响的独立性检验

• 为了验证作者构建的miRNA标志物预后价值的独立性，作者对所有791例样本进行了单因素和多因素的cox回归分析，如表2结果所示：作者发现，miRNA标志物是独立于年龄、分期、术前CEA水平等其他临床预后因素的CRC预后标志物。
• 为了验证多因素cox得到的结论，作者将年龄、分期、术前CEA（癌胚抗原，首先从结肠癌和胚胎组织中提取的一种肿瘤相关抗原）水平进行高低分组，两两一组共给出了6个KM生存分析图，结果显示在高龄、低龄、临床分期1/2期、3/4期、术前CEA水平正常、不正常任一条件下，本文的miRNA标志物的高、低风险组之间都有明显的中位OS差异，进一步证明了它预后价值的独立性（图4）

表2.单因素、多因素cox分析结果

图4.按临床预后因素分组的KM生存分析

• 接着，作者利用ROC曲线比较了miRNA标志物与其他临床预后因素的预测准确性，发现miRNA标志物的预测价值高于年龄、分期、术前CEA以及单个miRNA的预测价值；另外，作者还在曲线中加入了模型与临床预后因素结合的分组，发现整合后的模型的预后价值会得到进一步的提升（图5）

图5.ROC曲线判断miRNA标志物的预测准确性

6、基于miRNA的列线图构建

• 基于上述ROC曲线反映的将miRNA模型与其他预后因素相结合可以提高其预测准确性的结果，同时也为了提高该miRNA标志物的临床应用价值，作者将年龄、分期、术前CEA水平与miRNA模型的风险评分共同作为变量绘制了列线图（图6.A）；并在图6.B中给出了calibration plot（校准图），图中曲线非常接近斜率45度的正比例函数图像，说明列线图的预测值与实际观测值非常接近。
• 图6.C中作者给出列线图3年、5年的ROC曲线，二者的AUC值均大于0.7，说明该列线图具有很好的预测准确性

图6.基于miRNA标志物的列线图

小结

本篇文章中，作者利用HTS筛选出与缺氧相关的miRNA，并利用单因素、多因素cox回归分析构建了一个基于4个miRNA的风险评分公式。在利用FFPE组织样本进行预后价值验证后，作者又将该模型的风险评分与其他临床预后因素相结合绘制了列线图，提高了其预测水平和临床应用价值。