满分室间质评之GATK Somatic SNV+Indel+CNV+SV（下）性能优化

我们接上文：满分室间质评之GATK Somatic SNV+Indel+CNV+SV一文中实现了对于卫计委室间质评数据分析以及与满分结果的匹配。本文将着重解决，保证最终结果一致的情况下，如何优化分析性能（并行化），如何将分析时间从 3h 59m 53s缩短至 1h 10m 38s。

• 优化的方向：实际运行GATK4.X的工具如Mutect2时，发现其运行效率相当低，从CPU占用率，内存占用，硬盘I/O都占用很低，起初自己DIY时候，将要分析的bed/interval_list文件按照染色体编号拆分（不太确定分析结果的一致性，所以比较谨慎），然后并行分析，最后将结果合并。后来GATK从4.0.6.0升级到4.1.3.0时候发现官方的best practice pipeline也做了类似的处理，这里就有了优化的空间。
• 还有一些工具Cnvkit,Manta,samtools depth 和 samtools flagstat 运行时对硬件资源利用也不充分（CPU占用，内存、硬盘IO等），可以考虑把这些任务并行运行以减少最终的运行时间。
• 优化后结果的一致性，首先官方提供了一系列工具，从直接感觉上应该是没有问题的，从室间质评的结果来看，标准结果上的突变一致性没有问题。非标准结果上会有一些出入，不影响最终结果。当然，目前还做不到全自动，最终的结果还是要使用IGV人工检查一遍。

本文中分析流程（pipeline）的运行环境

本文用到的分析流程文件及结果

本文用到的环境变量

惯例:优化后分析流程(pipeline)：

下面看看优化过程

• INPUT 输入文件（无变化）

• Normal：Map & Order & MarkDuplicate 合并完成

  #bwa map完成接管道操作sambamba转换为bam，然后管道操作sambamba排序
  ${tools.bwa} mem \
      -t ${envis.threads} -M \
      -R "@RG\\tID:${sn}NC\\tLB:${sn}NC\\tPL:Illumina\\tPU:Miseq\\tSM:${sn}NC" \
      ${refs.hum}  ${data}/${sn}NC_R1.fastq.gz ${data}/${sn}NC_R2.fastq.gz \
      | ${tools.sambamba} view -S -f bam -l 0 /dev/stdin \
      | ${tools.sambamba} sort -t ${envis.threads} -m 2G --tmpdir=${result} -o {result}/${sn}NC_sorted.bam /dev/stdin
  #设置每个进程打开文件的最大数为10240,防止markdup时候sambamba报错退出
  ulimit -n 10240
  #使用sambamba对sorted.bam标记重复
  ${tools.sambamba}  markdup \
      --tmpdir ${result} \
      -t ${envis.threads} ${result}/${sn}NC_sorted.bam ${result}/${sn}NC_marked.bam 
  #sambamba生成的索引文件名与GATK默认的索引文件名不一致，这里重命名一下以符合GATK习惯
  mv ${result}/${sn}NC_marked.bam.bai ${result}/${sn}NC_marked.bai
  #删除${sn}NC_sorted.bam删除中间文件，节省硬盘空间
  rm -f ${result}/${sn}NC_sorted.bam

• Tumor：Map & Order & MarkDuplicate 合并完成

除了fastq文件不同，处理过程一模一样

• Recalibrator：Normal&Tumor 并行完成

• Process Dup Bam (对于标记重复后的Bam文件的处理，合并了很多步骤)

#此处是原先Manta分析SV的步骤一，生成runWorkflow.py，因为这一不步速度很快，所以串行执行 rm -f ${result}/${sn}/runWorkflow.py python ${tools.manta} \ --normalBam ${result}/${sn}NC_marked.bam \ --tumorBam ${result}/${sn}_marked.bam \ --referenceFasta ${refs.hum} \ --exome \ --callRegions /opt/ref/projects/Illumina_pt2.bed.zip \ --runDir ${result}/${sn} # 对bam文件碱基质量校正的第二步，Normal & Tumor并行处理 ${tools.gatk} ApplyBQSR \ --bqsr-recal-file ${result}/${sn}_recal.table \ -L ${refs.interval} \ -R ${refs.hum} \ -I ${result}/${sn}_marked.bam \ -O ${result}/${sn}_bqsr.bam & ​ ​ ${tools.gatk} ApplyBQSR \ --bqsr-recal-file ${result}/${sn}NC_recal.table \ -L ${refs.interval} \ -R ${refs.hum} \ -I ${result}/${sn}NC_marked.bam \ -O ${result}/${sn}NC_bqsr.bam & ​ #原先QC步骤，获取insert size，Normal & Tumor并行 ${tools.gatk} CollectInsertSizeMetrics \ -I ${result}/${sn}_marked.bam \ -O ${result}/${sn}_insertsize_metrics.txt \ -H ${result}/${sn}_insertsize_histogram.pdf & ​ ​ ${tools.gatk} CollectInsertSizeMetrics \ -I ${result}/${sn}NC_marked.bam \ -O ${result}/${sn}NC_insertsize_metrics.txt \ -H ${result}/${sn}NC_insertsize_histogram.pdf & ​ # 运行manta SV分析 python ${result}/${sn}/runWorkflow.py -m local -j ${envis.threads} & ​ # 运行cnvkit CNV分析 ${tools.cnvkit} batch \ ${result}/${sn}_marked.bam \ --normal ${result}/${sn}NC_marked.bam \ --method hybrid \ --targets ${refs.bed} \ --annotate /opt/ref/refFlat.txt \ --output-reference ${result}/${sn}_reference.cnn \ --output-dir ${result}/ \ --diagram \ -p 0 & ​ #samtools统计测序深度 ${tools.samtools} depth -b ${refs.bed} ${result}/${sn}_marked.bam > ${result}/${sn}_marked.depth & ${tools.samtools} depth -b ${refs.bed} ${result}/${sn}NC_marked.bam > ${result}/${sn}NC_marked.depth & #samtools统计比对信息 ${tools.samtools} flagstat --threads ${envis.threads} ${result}/${sn}_marked.bam > ${result}/${sn}_marked.flagstat & ${tools.samtools} flagstat --threads ${envis.threads} ${result}/${sn}NC_marked.bam > ${result}/${sn}NC_marked.flagstat & ​ #使用GATK Splitintervals工具将interval_list拆分成若干份。方便后面使用 #这里要讲讲从GATK4.1.3.0这个版本开始的骚操作了。我算法资源使用效率低是吧，我把interval文件拆分成几份，并行分析之后再把结果合并，来达到提高效率的目的。后面GetPileupSummaries和Mutect2都会用到。 #根据硬件性能决定拆分多少份，也就是并行多少个，我这里是8份 rm -f ${result}/${sn}/*.interval_list ${tools.gatk} SplitIntervals \ -R ${refs.hum} \ -L ${refs.interval} \ -O ${result}/${sn} \ --scatter-count ${envis.scatter} ​ wait

• Qc Process 处理以上文件，获取QC信息

• GetPileupSummaries

这里要讲讲GATK4.1.3.0这个版本开始的骚操作了。我算法资源使用效率低是吧，我把interval文件拆分成几份，并行分析之后再把结果合并，来达到提高效率的目的。

  # 这里循环拆分的interval_list文件运行GetPileupSummaries
  for i in `ls ${result}/${sn}/*.interval_list`;
  do
      ${tools.gatk} GetPileupSummaries \
          -R ${refs.hum} \
          -I ${result}/${sn}_bqsr.bam \
          -O ${i%.*}-pileups.table \
          -V ${refs.small.exac} \
          -L $i \
          --interval-set-rule INTERSECTION &
      
      ${tools.gatk} GetPileupSummaries \
          -R ${refs.hum} \
          -I ${result}/${sn}NC_bqsr.bam \
          -O ${i%.*}-pileups.nctable \
          -V ${refs.small.exac} \
          -L $i \
          --interval-set-rule INTERSECTION &
      
  done
  wait
  ​
  #将运行结果*.table文件作为参数合并成一行，运行GatherPileupSummaries将结果合并成一个
  tables=
  for i in `ls ${result}/${sn}/*.table`;
  do
      tables="$tables -I $i"
  done
  ${tools.gatk} GatherPileupSummaries \
      --sequence-dictionary ${refs.dict} \
      $tables \
      -O ${result}/${sn}_pileups.table
  ​
  nctables=
  for i in `ls ${result}/${sn}/*.nctable`;
  do
      nctables="$nctables -I $i"
  done
  ${tools.gatk} GatherPileupSummaries \
      --sequence-dictionary ${refs.dict} \
      $nctables \
      -O ${result}/${sn}NC_pileups.table

• CalculateContamination 计算污染

• Call SNV INDEL

  #vcf-file.list记录了并行分析输出的结果，后面合并要用到
  rm -f ${result}/${sn}/vcf-file.list
  touch ${result}/${sn}/vcf-file.list
  ​
  #循环使用拆分后的interval_list文件运行Mutect2
  for i in `ls ${result}/${sn}/*.interval_list`;
  do
     rm -f ${i%.*}_bqsr.vcf.gz
     ${tools.gatk} Mutect2 \
          -R ${refs.hum} \
          -I ${result}/${sn}_bqsr.bam -tumor  ${sn} \
          -I ${result}/${sn}NC_bqsr.bam   -normal ${sn}NC \
          -L $i \
          -O ${i%.*}_bqsr.vcf.gz \
          --germline-resource ${refs.af_only} \
          --native-pair-hmm-threads ${envis.threads} &
      echo ${i%.*}_bqsr.vcf.gz >> ${result}/${sn}/vcf-file.list
  done
  wait
  ​
  #生成合并参数，运行MergeMutectStats将状态文件合并
  rm -f ${result}/${sn}_bqsr.vcf.gz.stats
  stats=
  for z in `ls ${result}/${sn}/*_bqsr.vcf.gz.stats`;
  do
      stats="$stats -stats $z"
  done
  ${tools.gatk} MergeMutectStats $stats -O ${result}/${sn}_bqsr.vcf.gz.stats
  ​
  #合并并行分析得到的vcf.gz
  ${tools.gatk} MergeVcfs \
      -I ${result}/${sn}/vcf-file.list \
      -O ${result}/${sn}_bqsr.vcf.gz

• FilterMutectCalls 使用GATK提供的过滤器过滤SNV&Indel

• 将过滤后的文件转换为Annovar注释所需要的格式

• 使用Annovar注释

• 使用自己写的脚本对注释后的结果过滤，比如按照室间质评要求，过滤掉突变频率低于1%，测序深度低于500的突变。对GATK某些过滤器过滤掉的结果进行保留和排除，后面使用IGV进行人工筛选。最终输出的结果为，${sn}.result.SNV.xls（其实是个csv文件，扩展名改为.xls是便于使用excel打开，很多人都这么干）

• 使用CnvKIt，获取CNV突变（接Process Dup Bam）

• 使用py脚本文件，对CnvKit输出结果过滤。同样根据hg19_refGene.txt文件匹配基因，以及发生拷贝数变异的区域的外显子区域等。

• 使用CnvKit画图

• 使用python脚本对Manta获取的SV过滤。如根据SOMATICSCORE分数过滤，根据hg19_refGene.txt提供文件，计算突变基因等等。（接Process Dup Bam）

• 最终结果

• 整个pipeline运行情况，可以看到消耗时间明显降低，约为原先1/3时间。