慢病毒：肿瘤研究的利器

对于肿瘤领域的研究来说，基本都会涉及基因功能、细胞功能以及分子机制研究，这就需要基因递送载体来实现对基因表达的调控。常见的基因递送载体有质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等，其中慢病毒由于高感染效率、可感染范围广、可稳定整合的优点，成为最常用的基因递送载体，既可以感染细胞验证基因功能，又可以通过构建稳转细胞系进行成瘤和癌细胞转移等实验。因此，慢病毒（Lentvirus）可以说是肿瘤研究中必备利器。（来自吉满生物公众号）

常用的293T细胞转染效率就很高，但是大多数细胞转染效率通常比较低。据芒果本人经验，慢病毒在构建过表达、干扰和敲除方面都是效率极高的，甚至可以用于假病毒包装。我们前期分享过，Loss-of-function和Gain-of-function是进行表型研究必备的要素，而慢病毒则可以一箭双雕，都可以做到的。

除冠状病毒，其他常见病毒的受体也请大家参考。这些病毒受体本质上是膜蛋白，其分布决定病毒的嗜性。找到病毒的受体意义重大，但常常并不容易，比如北生所李文辉研究团队对乙肝受体的探索，精彩不亚于西游记。可是其方法难以推广，因为操作细节太多，繁琐。CRISPR/CAS9系统，越来越成为病毒研究者的武器。

病毒受体筛选的思路是，先构建CAS9稳转细胞（病毒嗜性细胞，通过蚀斑实验可观察到），再将含有靶向基因组的sgRNA Library导入细胞；在此基础上，感染相应的病毒，多数细胞会被病毒裂解，而受体被敲除的细胞则得以存活而富集；抽提细胞基因组后做PCR和深度测序分析，最终确定靶基因；再通过细胞或者动物模型验证，一篇论文便诞生了。下面以已发表论文为例，介绍CRISPR/CAS9系统在病毒受体筛选中的应用。

论文题目：

Human Neonatal Fc Receptor Is the Cellular Uncoating Receptor for Enterovirus B.

我们主要介绍载体构建和靶基因确定部分。

在用CRISPR/CAS9系统筛选病毒新受体时，必须使用双慢病毒载体，也就是说CAS9基因和sgRNA编码基因必须在两个慢病毒载体上；而定点敲除时，CAS9基因和sgRNA编码基因在同一个慢病毒载体上。

CAS9稳转细胞的构建

实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及辅助包装质粒，用无内毒素的试剂盒抽提，共转染 293T 细胞，转染后 18小时后更换为完全培养基，培养 48 小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，然后感染靶细胞。

实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株

1. 包装质粒 pSPAX2, pMD2G, pLenti-CAS9-puro。
2. 包装细胞 293T细胞。293T细胞生长状态要好，新复苏的细胞最好传代2次以上再用于病毒包装，传代次数超过20次的也不要用。正常情况下，293T细胞为贴壁依赖型成上皮样细胞。
3. 菌株 大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装质粒。

慢病毒包装

1. 质粒准备：浓度最好大于 0.5μg/μl，A260/280 在1.8-1.9。
2. 293T细胞：细胞铺板，6孔板按照（6~8）x10^5/孔铺板，一般早上铺板，第二天下午就可以做转染了。
3. 转染体系：pLenti-CAS9-puro，pSPAX2, pMD2G按照4：3：1的比例（2μg，1.5μg和0.5μg）混匀，再与转染试剂混匀加入前天准备好的293T细胞中，钙转或PEI转染，293T细胞的融合度再30%~50%即可。转染18~24小时后，更换为新鲜培养基。
4. 病毒收集：转染后 48 小时收集病毒上清，0.45 μm滤器过滤，2mL EP管中，4℃，3000g/min 离心 5分钟。

感染靶细胞

1. 细胞准备：将状态良好的目的细胞（上述论文中为RD横纹肌肉瘤细胞，是Entrovirus B的嗜性细胞）接种到6孔板，使浓度为 (4~6)×10^5/ml 细胞。
2. 第二天汇合率介于 50%~70%时，病毒液感染细胞。移去培养基并添加 1mL病毒上清液和1mL新鲜培养基，polybrene 终浓度为 6～8μg/ml（促进病毒感染），轻轻混匀，培养过夜。
3. 感染后第二天（约 24 小时），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续培养。感染后48小时，换上含适当浓度的puromycin 的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株。
4. 每2-3天换含puromycin完全培养液一次，至对照组细胞死光，可进行后续操作。有时还要进行T7E1实验验证CAS9酶切效果。

第一步CAS9稳转细胞株构建，完成。

第二步sgRNA library载体的慢病毒包装、感染与第一步类似，不再赘述。

这里，sgRNA library载体一般是带有荧光蛋白的，用293T细胞包装病毒或感染靶细胞时，都是可以在显微镜下看到荧光的，亮瞎眼的那种亮。

前两步实验完成。注意冻存细胞。

第三步实验目的是获得因受体被敲除的靶细胞，并进行扩大培养，获得足够的细胞。

这样，经过三个实验步骤，我们最终获得靶细胞。这个细胞的基因组既含有CAS9基因，又含有基因被sgRNA特定靶向敲除的sgRNA片段。由于sgRNA及其靶向基因是明确的，通过sgRNA序列，我们就可以得出被敲除的基因了。该基因编码的就是病毒受体蛋白。

第四步，抽提基因组和PCR扩增

完成靶细胞的富集和扩大培养后，抽提细胞基因组，这个市面上有很多试剂盒。接下来实验的关键是要做PCR扩增。模板是抽提得到的基因组，引物是什么呢？引物一般可以在Addgene官网sgRNA library载体对应的论文中查到。

扩增条件

在此条件下扩增得到的PCR产物是混合物，将其切胶回收后，送公司做深度测序，分析得出一系列sgRNAs及其靶基因。再根据相对丰度分析的结果，进行后续实验。

当你完成整个实验时，你会觉得思路是很清晰的，但是当你刚刚接触的时候，脑子可能都是迷糊的。最好的就是立即行动起来，认真想好每一步实验，可能整个系统你不清楚，但是每一个小的具体实验，要做到清楚。原理、步骤和材料要清清楚楚，在脑袋里过电影3~4次，这样实验的效率就提高了。其实就是化整为零的思维，把一个大目标分解成若干个小目标，一个一个地去突破。

希望对大家有所帮助，共勉。转载请注明出处。