NIPT/CNVseq/WES 数据如何更精确地区分性别

CNVseq一般针对的是流产物或者全血白细胞，是比较纯的组织样本，一般用比到Y染色体上的总reads数占总常染色体 reads数的比例，人为设置一个cutoff就能很轻易的区分性别。WES一般也针对的是全血白细胞，也可通过此方法来准确分性别。但NIPT数据一般测序量（5-8M single end reads）比CNVseq还少，在胚胎DNA含量较低的时候区分性别方面，如果再采用固定cutoff的方法，可能会因为没有屏蔽X和Y的同源区域或者非唯一比对区域，经常会出现性别分的不准的问题。

虽然国家明确禁止做胎儿性别鉴定，但我们要准确分析性染色体的非整倍性和性染色体CNV或嵌合情况的时候，还是要基于相同性别来做分析的，只有当异常的时候，我们才会对医生做提示。

现在NIPT的常规流程很多企业不仅仅只是分析染色体非整倍性了，而且也会去分析下CNV，有的企业甚至推出了NIPTplus(也有的叫NIPTpro)。这类产品是比普通NIPT实验建库方案进一步优化，测序量提升好几倍，能检测所有染色体的非整倍性，和一些常见发病率较高的胎儿可能携带的CNV。

其实NIPTplus分析CNV，主要思路还是和CNVseq差不太多，也是用的滑动窗口对reads计数，通过考察case与control样本在每个窗口的比值变化来分析拷贝数的变化，但对数据分析和实验建库的稳定性要求更高，这样我们才能尽可能减小假阳性。2015年博奥与广东省妇幼合作的 通过实验方法富集胎儿DNA，人为提高胎儿DNA比例的方法，也能有效减少假阳性。但我个人观点宁可通过增加测序量或在生信层面通过分析cffDNA片段来in silicon enrich 胎儿DNA的方法也行更可取。

回归正题，通过CNV分析，我们也对所有样本的Y染色体的每个滑动窗口做了reads计数。通过屏蔽掉X和Y同源的region、repeat region、non-unique region，然后对Y染色体的每个滑动窗口的read count用所有常染色体的reads数做均一化，接下来做好GC校正，我们就得到了一批次（FLow Cell）样本的 所有Y的每个滑动窗口的Normalized Read Count（NRC）。我用这个数据来做聚类，理论上就可自动精确区分好性别的。

但我用gplots的heatmap.2中默认的 hclust聚类方法，并没有很好地区分好性别。我仔细研读了下hclust中的几个methods，并找到了如下链接对这些methods做了精确描述。

https://uc-r.github.io/hc_clustering

我发现女性胎儿的Y染色体NRC总和占常染色体的NRC总和的比例一般都非常低，彼此之间的 variance也不大，而男性胎儿的这个比例可能因为胎儿DNA含量不同的关系，彼此之间variance比较大，但所有男性胎儿的这个比例都远比女性胎儿大。用最后一种hclust method，即ward.D方法也许最合适。

于是我写了R代码，并生成了聚类图，测试了一些数据，基本都能100%自动准确区分好性别了，以下是聚类图：