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曾与诺奖失之交臂的这项发现,今年还会继续陪跑么?

miRNA 的发现,与一位祖籍波兰的生物学家维克托·安博斯(Victor Ambros)的工作有关——他在线虫中发现了第一个 miRNA lin-4。

许多人认为,首次发现 miRNA 的安博斯同样应该在诺贝尔奖的历史上留下名字。由于诺贝尔奖评选委员会很少会针对同一个领域重复颁奖,所以尽管安博斯曾一度被提名诺贝尔生理或医学奖,却最终失之交臂。

但我们不得不承认,过去的几十年是我们对基因表达和转录后调控理解上的一场革命。

以前,蛋白质的基因组结构和亚型(例如转录因子和表观遗传介体)被认为是基因表达的唯一调节剂。

但是,近年来,参与转录后调控的 miRNA 和其他 ncRNA 揭示了对多种细胞功能至关重要的调控机制。

目前,研究人员在理解 miRNA 的生物发生和功能、编码 miRNA 的基因结构、靶向 miRNA 的序列特异性以及 miRNA 的应用方面取得了长足的进步,人们越来越关注 miRNA 作为细胞过程的重要调节剂以及在疾病的发生和发展中的作用。

今天我们就一起来探索一下这类小 RNA 的独特之处。

miRNA 的研究历程[1]

01

动物 miRNA 的发生

MicroRNA(miRNA)是一类内源编码的〜22 个核苷酸的非编码单链 RNA,占哺乳动物基因组的 2%。

30 年前,人们在研究线虫发育过程时发现 lin-14mRNA 的活性受到一个特殊负调控机制的影响,后来证明此负调控机制是 lin-14 编码的 miRNA 片段,能与 lin-14mRNA 的 3' 非翻译区(3'-UTR)不完全互补从而调控 lin-14 的翻译,从此开启了 miRNA 研究的新纪元。

miRNA 的生物合成来源于 RNA 聚合酶 II 和 III 直接从基因组 DNA 的不同区域转录长度高达几千 bp 的初始 miRNA 转录本(pri-miRNA)。

随后,pri-miRNA 由 RNAse III 酶 Drosha 和辅助因子 DGCR8 共同组成的复合体进一步加工以形成茎环或发夹结构前体 miRNA(pre-miRNA)。然后转运蛋白 Exportin-5(XPO5)、Ran-GTP 转运子将 pre-miRNA 从细胞核转运到细胞质。

在这里,它们被另一种 RNAse III 酶 (dicer 酶) 剪切成小的双链 RNA(dsRNA),其中 5' 端热力学稳定性最差的一条与 TRBP 结合并富集 Argonaute 蛋白(AGO),形成 RNA 诱导的沉默复合物(RISC),这条链即为成熟 miRNA,另一条为互补链。

RISC 复合物通过 miRNA 与 mRNA 的 3'-UTR 的靶位点结合来进行翻译抑制和靶向 mRNA 降解,继而介导基因沉默。另一条互补链本应趋向于降解,但 Ro 及其同事对小鼠和人的 969 个 miRNA 分析时发现了 117 条互补链,说明可能存在双链 miRNA,且不论是成熟体还是互补链都具有组织特异性。

动物 miRNA 的发生[2]

02

miRNA 的调控机制

长期以来,研究人员已经观察到 RISC 可以在细胞核以及细胞质中介导转录后基因沉默(PTGS),从而影响胚胎发育,调控物质代谢,介导信号传导,参与细胞凋亡、病毒感染以及疾病的发生。

miRNA 与其靶 mRNA 结合的主要决定因素是 miRNA 5' 端的 6~8 个核苷酸序列,即「种子」序列。miRNA 与种子区域之间的任何序列互补都会触发靶 mRNA 表达水平的下降。

种子序列匹配可发生在基因的任何区域,但更可能存在于 mRNA 的 3'-UTR,根据与 3'-UTR 靶序列同源的程度,miRNA 可以诱导 mRNA 的翻译抑制或降解。鉴于每个 miRNA 能够调节许多基因的表达,所以每个 miRNA 可以同时调节多个细胞信号通路。

细胞质中的 PTGS 是 miRNA 通过 miRISC 介导的经典功能。如,miR-139-5p 和 miR-144 能够在 mRNA 和蛋白质水平上降低 TET2 和 TET3 的表达。

PTGS 的第一步是识别,基本原则包括规范的 Watson-Crick AU、GC 配对和非规范的 GU 配对。在靶 mRNA 上有一个特殊的 miRNA 反应元件(MRE),用于 miRNA 识别和结合。MRE 与 TET2 和 TET3 mRNA 一样,大多位于 mRNA 的 3'-UTR,但是一些研究表明,它也出现在 5'-UTR 中,甚至出现在蛋白质编码序列中。

miRNA 在细胞核中可以起增强子的作用。增强子是能够上调基因转录的基因组顺式调控元件。在 miRNA 基因(MIR)中发现了包括 H3K27ac 在内的一些增强子标记。一些 miRNA,如 miR-26a-1,miR-339,miR-3179,miR-24-1,miR-24-2,已被证明能够诱导邻近基因的表达。由 miRNA 诱导的增强子激活需要 Ago2 直接在基因座处发挥作用或将成熟的 miRNA 从细胞质带到细胞核。

除了上述 miRNA 的传统作用机制外,最近还发现了其他「非经典」作用机制。一些证据表明,miRNA 可以通过在靶 mRNA 的 AU 富集区域募集蛋白质复合物来增加靶 mRNA 的翻译,或者通过相互作用和调节阻遏蛋白来间接提高靶 mRNA 的水平。另有证据表明部分 miRNA 能提高核糖体合成,从而调节蛋白质的合成,或跳过细胞周期停滞,从而激活靶基因抑制。

03

miRNA 的生物信息学工具

自从 1993 年发现第一个 miRNA lin-4 以来,已经鉴定了 271 个物种中的 48,885 个成熟 miRNA,并将其存放在金标准存储库 miRBase 中。至今,已经针对 miRNA 生物发生的每个过程开发了许多生物信息学工具,包括用于 miRNA 预测发现、结构分析和靶标预测。

miRNA 研究的历史时间表以及生物学数据库开发 [3]

注释工具是该领域中最重要的工具之一。

每个 miRNA 序列、pre-miRNA 二级结构和 miRNA 基因位点等都需要一个 miRNA 数据存储库。miRBase 是此领域主要的存储库,收集了所有已知的 miRNA 序列和所有物种的注释。

Rfam 是用于 RNA 注释的统一系统,包含了 miRNA 家族信息。miRIAD 容纳了 miRNA 及其宿主基因的信息,mirtronPred 从内含子序列预测 mirtrons,mirSTP 用于识别 miRNA 转录起始位点(TSS),MetaMirClust 提供有关 miRNA 簇及其保守性的全面信息。

其次,miRNA 的二级和三级结构对于特异性结合蛋白的识别或与其他 RNA 的相互作用非常重要,结构特征和自由能是预测 miRNA 分子的关键特征。ViennaRNA 和 RNAstructure 是代表性的 miRNA 结构预测工具。

miRNA 的鉴定识别系统也是一个重要工具,MiRscan 可用于鉴定线虫中保守的 miRNA。miRNAFold 是一种 ab initio 用于从基因组中大规模预测 miRNA 的快速工。还有基于下一代测序(NGS)数据识别 miRNA 的工具,如 miRDeep 和 miRanalyzer。

切割位点、结合和靶标发现工具对于 miRNA 研究也十分重要。

LBSizeCleav 和 PHDcleav 工具可以用来预测 pre-miRNA 中的 Dicer 切割位点。miRBShunter、Antar 和 miRTar2 GO 可以用来检测来自 AGO-CLIP-Seq(例如 AGO-PAR-CLIP 和 AGO-HITS-CLIP)的 miRNA 结合位点。

还有 miRanda,TargetScan,PicTar,RNAhybrid 和 PITA 等也可以用来预测 miRNA,研究其功能,miRecords 和 miRTarBase 也是经过验证的 miRNA 目标数据库。

另外,将 miRNA 与表型相关联是注释 miRNA 功能的另一种方法。

HMDD 收集了人工治愈的人类疾病相关的 miRNA,PASmiR 包含用于植物的特定 miRNA,CERNA 包含 miRNA 的反应元件(MRE)。

miRNA 相互作用网络也是时下流行的研究方向,starBase 和 PceRBase 等数据库记录了特定类型的 RNA 相互作用(例如,miRNA-lncRNA,miRNA-circRNA 和 miRNA-mRNA)。

细胞外 miRNA 是临床应用的潜在生物标志物,专门收集在 miRandola 和 ExoCarta 等数据库中。

每个过程中的生物信息学工具[3]

04

miRNA 的应用

miRNA 是许多生理功能的重要调节剂,在细胞发育、分化和体内平衡过程中形成了复杂的调控网络,其功能的失调与越来越多的人类疾病(尤其是癌症)相关,研究人员希望能用 miRNA 来开发新的疾病治疗策略。

4.1 miRNA 在癌症治疗中的应用

miRNA 失调,无论是致癌性 miRNA 的过表达还是抑癌性 miRNA 的下调,都可能引起恶性肿瘤。据报道,核 miRNA 通过作用于相应基因位点的启动子而参与多种肿瘤启动子/阻遏物基因或与癌症相关的基因的转录调控。

使用 miRNA 来开发新的肿瘤治疗策略主要基于以下两种方法:

  • 将 miRNA 用作药物分子,基于特定寡核苷酸的合成和传递,能够增加或降低肿瘤组织中 miRNA 的水平;
  • 调节 miRNA 结合非基于 miRNA 的药物疗法以提高常规疗法的疗效。

基于 miRNA 的癌症疗法是一种通过恢复 miRNA 对抗发病机制的策略。主要采用拮抗剂和模拟寡核苷酸(通常称为「antagomiR」)以抑制在人类疾病中病变的 miRNA。

miRNA 通过高度特异性的 Watson-Crick 碱基配对作用,对于高表达的致癌性 miRNA,配对碱基可被 antagomiR 封闭,该寡核苷酸可与 miRISCs 高亲和力结合从而破坏其抑制功能。对于抑制肿瘤的 miRNA,miRNA 模拟物可以恢复 miRNA 的功能。

目前许多制药公司也在开发靶向 miRNA 和拮抗 miRNA 疗法,其中最成功的基于 antagomiR 疗法是针对 miR-122 的靶向治疗。

miR-122 在肝脏中高表达,是 HCV 复制中必不可少的辅助因子。研究人员用与 miR-122 完全互补的 2'-OMe 反义 RNA 处理细胞系消除了 HCV 复制。

由 Santaris Pharma 和 Hoffman-La Roche 开发的 Miravirsen 基于 miR-122 的疗法已经进入临床试验,并且在非人类灵长类动物中具有良好的耐受性,大大降低了 HCV 负担,很可能成为第一个基于 miRNA 的治疗药物进入市场。

miR-21 的过表达与几种类型的癌症发病机理有关,其体外抑制实验导致胶质母细胞瘤、乳腺癌和肝癌细胞死亡。Regulus Pharmaceuticals 已开始研究抗 miR-21 用于肝癌和 Alport 综合征的研究,并已经开始了肝癌治疗的临床前试验。

4.2 miRNAs 作为诊断和判断预后的生物标志物

在临床医学检测中,我们经常对生物标志物进行测量以帮助诊断,此标志物应具有特异性、敏感性、无创性、在流行病学组之间保持一致、易于量化且具有成本效益的特点,重要的生物标志物也应随疾病或治疗的进展而改变,以便于监测。

由于 miRNA 可由实体瘤分泌到周围环境中并且在体液中稳定存在,能在血浆、唾液、牛奶和脑脊液等体液中检测到,且易于通过微阵列、NGS 和定量 PCR 进行检测,所以是生物标志物的理想候选者。

MiR-21 是研究最多的癌基因 miRNA 标志物之一,在几乎所有人类癌症中都检测到过表达,它负调节肿瘤抑制基因 PTEN 以及促凋亡蛋白 BAX 的表达。因此,miR-21 的过表达与肿瘤侵袭性相关,同时抑制细胞凋亡。

在淋巴瘤(DLBCL)患者的血清样本中 miR-21、miR-155 和 miR-210 表达上调。在乳腺癌(BC)患者血液中 miR-195、miR-29a、miR-21、miR-16、miR-25、miR-222 和 miR-324-3p 表达升高。miR-155 在 B 细胞成熟中起作用,在 B 细胞和血浆中检测到 miR-155 升高可诊断为 B-CLL。

AML 患者血清中的 miR-150 和 miR-342 含量较高,且在完全缓解的 AML 患者中,miR-150 和 miR-342 恢复到正常水平,表明这两种 miRNA 可以成为监测治疗效果的生物标志物。

除了用于疾病的预测外,miRNA 还可作为药物治疗的预测生物标志物。miRNA 的表达受药物影响,而且本身也可能影响药物的代谢和毒性,因此 miRNA 的表达也可用作药物功效的潜在生物标记,特别是循环 miRNA,例如,miR-21 的高表达和 miR-200b 的表达下调与对多种化疗药物的耐药性有关,可以作为患者对化疗反应的预测性替代生物标志物。

4.3 microRNAs 用于药物功效和药物安全性评估

药物引起的肝损伤、心脏毒性和肾毒性是药物开发过程中的主要问题。由于 miRNA 参与了不同器官在药物诱导的毒性中的作用(例如肝脏、心脏、肾脏、肌肉、中枢神经系统和生殖器官等),因此可以利用 miRNA 评估药物安全性。

目前检测患者药物性肝损伤的临床实践标准是测量血液样本中的生物标志物水平,如 ALT、AST 、ALP 和胆红素,然而,这些生物标志物敏感性和特异性低,不能进行早期诊断。

在器官损伤期间,miRNA 通常会释放到生物流体中且稳定存在,因此,在血液或尿中的 miRNA 可被作为非侵入性生物标记物用于检测肝脏疾病和毒性,且检测方法简单、经济、高效。目前,已经鉴定出指示肝损伤的肝特异性 miRNA,如 miR-122。

在药物心脏毒性的预测中,最广泛使用的血清蛋白生物标志物 cTnI 和 cTnT 只在组织损伤已经发生 3-12 小时内升高,敏感性低,不适合快速测定。

研究人员在使用啮齿动物进行的急性心脏毒性研究和人类心肌损伤的研究中,已经在血液中检测到了心肌特异性 miRNA,这些 miRNA 用作心脏毒性的相对无创性循环预测指标在药物安全性评估中具有巨大潜力,尤其是在临床前模型中。

总尿蛋白、葡萄糖 N-乙酰基-β-(D)-氨基葡萄糖苷酶、血清肌酐和尿素氮(BUN)已被用作肾毒性的生物标志物,这些标志物的升高通常与已确定的肾损伤有关,不能进行早期快速的检测,Blatt 等人报道了使用 miRNA 检测顺铂的肾毒性,表明 miRNA 在肾脏损伤的发病机理中起作用,并且可以充当肾毒性的生物标志物。

miRNA 调节药物疗效和安全性[4]

自从 1993 年发现 miRNA 以来,人们不断深入探索此领域,了解了它们在基因组中的编码方式、转录方式和加工方式以及抑制蛋白质翻译的机制,逐渐认识到这些转录后调节因子在生理调控中的重要性,同时也意识到这些小 RNA 作为疾病诊断治疗的巨大潜力。

但目前我们对 miRNA 的了解尚浅,基于 miRNA 的治疗与诊断还有很长的路要走,基于 miRNA 的疗法的主要问题是如何组织特异性递送,为了避免 miRNA 的快速降解和排泄,开发出可以增强稳定性和靶向组织的新递送系统也极为重要。

总之,miRNA 为疾病的诊断治疗提供了崭新的平台和思路,将成为精准医疗领域的后起之秀。

参考文献(上下滑动查看):

1.Weiss CN, Ito K. A Macro View of MicroRNAs: The Discovery of MicroRNAs and Their Role in Hematopoiesis and Hematologic Disease. Int Rev Cell Mol Biol. 2017;334:99-175. doi:10.1016/bs.ircmb.2017.03.007

2.Bertoli G, Cava C, Castiglioni I. MicroRNAs: New Biomarkers for Diagnosis, Prognosis, Therapy Prediction and Therapeutic Tools for Breast Cancer. Theranostics. 2015;5(10):1122-1143. Published 2015 Jul 13. doi:10.7150/thno.11543

3.Chen L, Heikkinen L, Wang C, Yang Y, Sun H, Wong G. Trends in the development of miRNA bioinformatics tools. Brief Bioinform. 2019;20(5):1836-1852. doi:10.1093/bib/bby054

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7.金吉春. (2013). Microrna 的概述及其研究. 医学研究生学报, 26(010), 1109-1112.

8.齐斌 余丽梅. (2014). Microrna 概述及其研究进展. 组织工程与重建外科 (10), 357-359.

文章来源:威斯腾生物

图片来源:威斯腾生物

题图来源:站酷海洛

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原始发表时间:2020-10-02

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