纯生信也能发到18分！这个预后型Biomarker套路，感觉没什么难度！

挑圈联靠解读18分+预后型Biomarker生信文章套路

小伙伴们，大家好，我是汇然。今天来为大家分享一篇2018年10月发表在Annals of Oncology的一项研究，题目为“Association between PD-1 mRNA and response to anti-PD-1 monotherapy across multiple cancer-types”。影响因子为18.274。本期分享我会带大家以“挑圈联靠”的生信思维来解构范文的思路框架，让大家有种学习完就迫不及待想要发文的冲动！哈哈，言归正传，我们先来介绍一下背景知识。

一.背景知识

我们都知道癌症的特点是不同的基因改变积累，导致癌细胞表面出现不同的新抗原表达。人体免疫系统是机体发现和消灭肿瘤细胞的可靠“人体警察”。然而，肿瘤细胞可以利用机体内的免疫调节剂促进其自身发生“免疫逃逸”，人们先前认为的可靠“人体警察”则成为肿瘤逃逸的“帮凶”，这一发现影响了免疫抗癌疗法的发展趋势，比如抗PD-1或抗CTLA4抗体“免疫检查点抑制剂”。抗PD-1药物如nivolumab或pembrolizumab对超过15种癌症类型的临床疗效显著。这些药物对22种癌症的总体反应率(ORR)在0%到50%之间各不相同。因此，有必要筛选抗PD-1治疗的获益人群。那么预测抗PD-1单药治疗疗效的可重复性生物标记物可能具有临床价值。在作者团队先前的研究中已经报道了使用nCounter平台检测免疫相关基因（包括PD-1）的表达是可重复的，且与65例晚期肿瘤患者的抗PD-1单药疗法疗效相关。在这里，我们假设肿瘤样本中PD-1 mRNA的丰度可以解释不同类型肿瘤抗PD-1单药治疗后总ORR的差异。

最近的研究支持了通过IHC检测PD-L1表达作为pembrolizumab在非小细胞肺癌(NSCLC)中的潜在生物标志物的作用。然而，它对其他癌症类型的预测价值，或与其他抗PD-1药物，是有争议的。此外，基于的PD-L1检测有重要的局限性，如所用抗体的敏感性不同，以及在评分和切断测定时的主观性。因此，识别可重复应用的生物标志物来预测抗PD-1单药治疗的疗效可能具有临床价值。之前，我们报道了利用nCounter平台表达的免疫相关基因，包括PD-1，是可重复的，并与抗PD-1单药治疗65例晚期癌症[1]患者的疗效相关。于是作者提出科学假设：肿瘤样本中PD-1 mRNA的丰度可能解释抗PD-1单药治疗癌症后观察到的总体应答率(ORR)的差异。

二.思路框架构建

本文围绕着“肿瘤样本中PD-1 mRNA的丰度可能解释抗PD-1单药治疗癌症后观察到的总体应答率(ORR)的差异”这一问题展开生物信息学分析。也就是说范文主要想通过PD-1 mRNA表达水平预测不同类型肿瘤抗PD-1单药治疗的预后，是一篇预后类型的生信文章。创新点就在于抗PD-1单药治疗与肿瘤适应性免疫反应间的关联，是否可以通过PD-1表达水平来预测呢？那么这样一个临床问题是如何通过生信分析方法来解释呢？答案还是“挑圈联靠”！

我们也按照生信文章四步曲来锻炼一下生信思路设计，根据科学假设“挑”也就是选择差异基因。既然是研究免疫检查点抑制剂疗效，肯定需要免疫相关基因。这里可能会需要免疫相关基因列表，从哪里获得呢？可以从免疫数据库，文献报道，公共数据集等等获得。

问题又来啦！有了免疫相关基因我们可以用来做什么呢？我们可以分析这些基因与我们的主角PD-1间的相关性呀~可以进一步缩小Hub基因范围，得到与PD-1相关的共表达基因呀~之后就是功能富集，分子交互，临床应用这一套流程做下来。有了创新的差异分子集合发不到18分，灌灌水也是可以了吧~还能套上热点问题高调的讨论一番，让审稿专家们眼前一亮，即便文章一看上去中（套）规（路）中（满）矩（满），也会加上不少印象分！

感慨一番~我们还是回到文章当中来，18分+的文章肯定是有它自己的特色，绝不仅是差异分析、功能富集这么简单。通过科学假设我们可以看出文章中肯定用到了临床试验，那就需要组织样本。换做我们这些小学生没有临床样本可以通过哪些方法代替呢？当然，查阅文献必不可少，自己没有数据可以参考公共数据库，自己没有组织也可以借用别人的组织样本信息嘛~如果有条件的小伙伴，用上自己的样本那当然又是大大的加分项！有了临床样本就有了蛋白水平的表达差异，同时有了临床信息。接下来就要靠临床意义，还是这一套分析流程，换汤不换药。接下来我们边学分析方法，边剖析分析结果。

三.分析方法

作者对TCGA数据库中泛癌标本的RNAseqv2数据进行分析。研究18个免疫相关基因特征和547个免疫相关基因（包括PD-1）。分析每个基因/特征和文献报道的抗PD1单药治疗后ORR之间的相关性。为了将分析结果转化为临床，作者使用nCounter平台分析了17种肿瘤类型中的773例FFPE肿瘤样本的PD-1 mRNA表达。为了检测PD-1 mRNA、PD-L1的免疫组化作者评估了117例晚期肿瘤患者接受抗PD1单药治疗的独立数据集。

四.结果剖析

表达差异 & 分子交互

1.TCGA中与表达相关的PD-1免疫相关基因

首先，作者合并了TCGA数据库中34种不同肿瘤的10078个样本的RNA序列数据（Fig.1A）。从15557个基因中选出包括PD-1在内的547个免疫相关基因（Fig.1B）。随后利用DAVID数据库分析PD-1的共表达基因，以r>0.80为限定值筛选了强相关的30个基因（包括CD3和CD8A），这些基因在CD8 T细胞活化等生物学过程中显著富集（P<0.001）（Fig.1C）。这与单基因分析结果一致，PD-1与T细胞活化的免疫相关基因表达特征（GES）强相关（r>0.80）。PD-1表达与其他免疫检查点抑制剂如LAG3（r=0.75）、PDL2（r=0.55）和PD-L1（r=0.45）之间的相关性较低（Fig.1D）。

▲ Fig.1A-D

2.TCGA数据库PD-1在泛癌中的表达差异

研究发现34种肿瘤的PD-1表达在不同肿瘤类型之间和同一肿瘤类型之内的表达变异性很大.图中红线在每个cancertype表示值的表达式。作者将样本按照整个队列中PD-1的中位表达量进行排序，水平线表示50%和80%的PD-1表达量。例如，当以组合矩阵中第80百分点作为界定PD-1高表达与PD-1低表达的临界值时，每种肿瘤类型中PD-1高表达肿瘤的比例在0%~84%之间（Fig.1E）。

▲ Fig.1E

疗效相关性分析 & 临床意义

1.免疫相关基因表达和抗PD-1抗体疗效

Fig.1F比较了每一种癌症类型中高PD-1比例进行分析的图以及抗PD-1单药治疗后报告的总体应答率(ORRs)。在PD-1平均表达最高的肿瘤类型中，接受抗PD-1单药治疗（如黑色素瘤）患者的ORR最高。在PD-1平均表达最低的肿瘤类型中，接受抗PD-1单药治疗（如胰腺癌）患者的ORR最低。这些数据表明，不同肿瘤类型之间和同一肿瘤类型之内的PD-1表达丰度可能与抗PD-1疗效有关。为了确定不同肿瘤类型中生物标记物高表达肿瘤的比例，作者在组合矩阵中评估了6种不同的临界值（即第50至第90百分点和平均值）。结果显示，在565个生物标记物中（即547个个体基因和18个GES），PD-1与ORR高度相关（r=0.74~0.91），并且与被评估的6个截止点的前三个生物标记物保持一致（Fig.1G）。在本研究中还描述了PD-1高百分比(80%)与以往文献报道的不同实体肿瘤抗PD-1单药治疗后ORR的相关性（Fig.1H）。

▲ Fig.1F-H

2.肿瘤突变负荷（TMB）和抗PD-1抗体疗效相关性

为了探讨PD-1 mRNA和TMB之间的关系，作者使用TCGA数据库中来自8792个肿瘤样本和31个肿瘤类型的PD-1 mRNA和TMB数据。在这个组合数据集中，PD-1 mRNA和TMB之间没有相关性（r=0.09）。然而，PD-1高表达肿瘤的TMB平均值（9.44）明显大于PD-1低表达肿瘤的TMB平均值（5.61；P<0.001）。并且TMB与ORR之间的相关系数为0.61（P=0.011），而PD-1 mRNA（80%作为截止值）与ORR的相关系数为0.91（P <0.001）（Fig.S3）。这些计算机分析结果表明，与TMB相比，PD-1 mRNA可能是一个更好的抗PD-1疗效的预测指标。

▲ Fig.S3

3.临床样本PD-1表达分析

作者利用了临床773个代表17种肿瘤类型的组织样本，分析不同肿瘤类型的PD-1表达，并确定了第80%的表达值，该百分点定义了PD-1高表达与PD-1低表达的肿瘤（80%表达值=6.3）（Fig.2B）。

▲ Fig.2B

接下来，比较了内部数据集和TCGA数据库（Fig.2C）之间每种癌症类型中PD-1高表达肿瘤的比例。在两个数据之间，16种肿瘤类型中15种的PD-1高表达肿瘤的比例没有显著差异（Fig.2D）。

▲ Fig.2C-D

4.PD-1表达与抗PD-1疗效的直接关系

与我们之前根据科学假设推测的分析方法一致，作者以117例接受抗PD-1单药治疗的晚期肿瘤患者根据PD-1 mRNA预先确定的临界值（6.3）“靠”临床意义，结果显示28.2%的样本被确定为PD-1高表达（Fig.2G）。与是否具有良好的临床疗效对比，以PD-1高表达肿瘤的ORR为51.5%，而其余的ORR则为23.8%，均具有显著统计学意义（Fig.2H）。

▲ Fig.2G-H

5.PD-1 mRNA与其他生物标志物的相关性

在这里，作者选用的验证数据集包含84个可评估样本，发现PD-1 mRNA与sTILs这两个生物标志物之间的相关性系数r=0.53，表示相关性并不很强。从抗PD-1疗效的相关性来看，连续变量sTILs的表达与疗效不存在显著相关性（OR=1.01；95% CI：1~1.1；P=0.197），而PD-1作为一个连续变量与疗效显著相关（OR=1.32；95% CI：1.0~1.73；P=0.034）。在以63%为限定条件的74个可评估样本中，PD-1 mRNA与PD-L1两个生物标记物之间没有发现相关性（r=-0.04）（Fig.S4)。

▲ Fig.S4

6.生存分析

最后，作者基于PD1 mRNA的表达及逆行无进展生存分析(PFS)（Fig.2I）。

▲ Fig.2I

五.范文总结

首先，我们明确本篇范文的目的就是更好地了解与抗PD-1抗体药物活性相关的生物学特征，并确定观察疗效的预测性生物标志物。

目前，免疫组化检测PD-L1表达仍然是pembrolizumab治疗NSCLC唯一被认可的伴随诊断，但该生物标记物存在严重的技术局限。同时，PD-L1在其他肿瘤和其他抗PD-1药物（如nivolumab）中未能发现其具有预测性。因此，有必要借助诸如nCounter这样已被报道具有高度可重复性的平台，在临床上实施稳健且可重复的基因组分析。

作者比较自己团队来自不同的研究队列内部泛癌数据库样本和TCGA数据库（早期疾病>90%）之间PD-1高表达的比例，结果是相似的。这一结果表明，在同一类型肿瘤和不同类型肿瘤之间的T细胞活化量是一个基于人群的稳定现象。除基因表达外，也出现了其他抗PD-1治疗敏感性的遗传生物标志物。其中最有潜力的是肿瘤突变负荷（TMB）。抗PD-1治疗后ORR最高的肿瘤类型实际上也是TMB最高的肿瘤类型。并分析之前的研究，有观察到TMB与其疗效直接相关。然而，TMB是否能直接预测其他肿瘤类型的抗PD-1治疗疗效还需要证明。此外，还需要进一步的研究来确定TMB的分析有效性和临床实用性。

TCGA数据与我们的和其他研究中的ORR进行计算机分析比较在临床试验之外治疗的晚期肿瘤患者（主要是黑色素瘤和NSCLC）的有限和异质性数据集中，评估了PD-1表达和抗PD-1疗效的直接关联，并证实基于PD-1表达的抗PD-1的疗效梯度。

总之，作者的研究结果与假设一致：使用PD-1 mRNA表达水平来识别预先存在且稳定的适应性免疫反应，可以预测不同类型肿瘤抗PD-1单药治疗的预后。

小伙伴们在学完这篇18分+干湿结合预后型Biomarker文章后有没有受到些生信思维上的启发呢？只要明确研究目的，再去赵相关的数据集，利用“挑圈联靠”的思路一步步做下来，你也可以发表高分生信文章呢！后台回复“汇然18”获取范文文献，如果你对这样的学习方式感兴趣，或者有什么意见或建议，请在下方留言~我们下期再见吧，拜拜！

参考文献

[1]Prat A, Navarro A, Paré L et al. Immune-Related Gene Expression Profiling After PD-1 Blockade in Non–Small Cell Lung Carcinoma, Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, and Melanoma. Cancer Research 2017; 77: 3540-3550.

[2]Pare, L., et al., Association between PD-1 mRNA and response to anti-PD-1 monotherapy across multiple cancer types. Ann Oncol, 2018. 29(10): p. 2121-2128.