JMC | 中国药科大学尤启冬/姜正羽教授团队报道Azo-PROTAC光诱导蛋白降解

作为21世纪药物研发领域的新秀，PROTAC技术给被打上“不可成药”标签的靶点蛋白带来了希望，传统小分子药物需要与酶或受体的活性位点结合才能够发挥药效，但多数蛋白并不具备这样的位点，PROTAC能够使它们从“不可成药”（undruggable）变成“可成药性”（druggable），近些年来，该技术在药物研发中遍地开花，已经开发出了多个小分子降解剂，取得了一系列优异的成果。有人评价PROTAC技术给药物开发带来颠覆性的变化。

与此同时，随着研究的不断深入，PROTAC的硬伤一个个暴露出来。因为分子量较大，在合成上会比较困难，药物动力学（PK）也是小分子降解剂成药的一大障碍。最让研究者牵挂的是它的脱靶毒性，传统抑制剂与靶蛋白的结合并不是百分百完全结合，这一点保证了药物不会对正常细胞生理功能有明显影响，但降解剂不同，不受控制的降解过程导致靶蛋白大量被降解，会不会引起毒性作用，另外会不会误伤到其他的蛋白，带来更大的毒性，在后期开发中这也是要考虑的风险。

因此，新一代PROTAC技术提出了 “降解可控性”的概念，给降解剂的研发带来了新的挑战。不过，更大的挑战意味着更多的机遇。近日，中国药科大学尤启冬/姜正羽教授团队报道了利用Azo-PROTAC技术实现光诱导的可控性小分子蛋白降解剂，提高了降解精度，避免可能毒性。该成果发表在药物化学期刊《Journal of Medicinal Chemistry》。

传统抑制剂仅仅阻断靶标蛋白的催化活性，而降解剂作为双功能分子，降解目标蛋白的同时，因为自身具有的催化属性，不可避免地存在因完全耗竭目标蛋白带来毒性作用的可能。为了实现PROTAC的可控性，作者设计了引入偶氮基团（azobenzene，Azo）作为光控开关，连接E3连接酶配体和靶蛋白配体，利用光控技术实现对BCR-ABL融合蛋白的可控降解。

光控技术在化学生物学领域有着广泛的应用，如利用UVA照射治疗血液和皮肤癌症，具有高度时空精准特性。已有的共晶结果显示来那度胺结合口袋很小，并且在溶剂区还有很强的空间位阻，借助对光解概念的理解，作者最终选择在来那度胺苯基3位引入偶氮基团。另一端连接的ABL抑制剂达沙替尼是第二代酪氨酸激酶抑制剂，对接结果显示只有当分子为反式构型时，来那度胺部分才能够进入结合口袋，这意味着不同构型的分子降解活性会有比较大的差异，这是实现降解可控性的前提条件。

考虑到合成上的难度，最开始他们先合成了最短的Azo-PROTAC-2C，通过Western-Blotting证明确实引起K562细胞株中ABL和BCR-ABL融合蛋白表达量的显著下降。紧接着，他们又延长碳链，相继合成了Azo-PROTAC-3C、4C、5C、6C，其中4C下调效果最为明显。

为了证明4C的特异性，对应合成了戊二酰亚胺的N-甲基化产物作为阴性对照4C(-)，结果证实4C(-)对BCR-ABL没有降解能力，也验证了4C是依赖于来那度胺作为E3连接酶，结合CRBN蛋白激活泛素-蛋白酶通路实现降解功能。

通过docking分析推测化合物构型会对降解能力产生较大影响，为了验证这一推测，他们分别测试了顺式（cis-4C）和反式（trans-4C）对BCR-ABL蛋白的降解能力，通过比较发现，反式构型化合物降解能力表现出时间浓度依赖性，在给药4 h后蛋白表达量开始下降，32 h降解量超过90%（E），给药浓度为100 nM效果最好（G）；而顺式构型化合物即使在500 nM最高浓度给药后，蛋白表达量仍未有明显降低（F、H）。这一结果为下一步的可控性验证提供了前提基础。

为了证明降解的可控性，他们用化合物4C的顺式和反式构型做了紫外可见吸收光谱，其中偶氮基团在361 nM处有最大吸收波长，当用UV-C照射trans-4C时，361nM处峰值随照射时间不断变小，1h后与顺式构型谱图几乎完全重合，这说明构型已经发生了完全转换。而在白光照射下的转化时间为4h；与之类似，cis-4C在可见光照射下也会逐渐转变为trans-4C。该实验结果说明了4C可以通过光控调节构型比例来切换降解模式，达到可控目的。

最后对降解剂光控开关的可逆性也进行了评价。首先是模拟开关打开过程，用cis-4C对K562细胞预处理后避光培养，之后暴露在可见光下，与避光组结果相比，光照组BCR-ABL表达量随时间明显降低。同样地，用trans-4C对K562细胞处理后，分为两组，一组用紫外照射，一组暴露在可见光下，紫外线照射组BCR-ABL表达量随时间逐渐增加，这是因为紫外照射使trans-4C构型反转，比例逐渐降低，降解能力下降，而可见光组蛋白表达量始终维持在较低水平。这充分说明了Azo-PROTAC-4C对BCR-ABL蛋白的降解过程是完全可控并且可逆的。

总 结

基于化合物不同构型降解能力的差异，引入偶氮基团作为光控开关，利用光照改变构型配置比例实现对靶标蛋白的可控降解，可以有效避免非特异性降解带来的毒性问题。Azo-PROTAC技术也为光学药理在PROTAC技术中的应用提供了很好的一个示范。