【生信文献200篇】18 新的抑癌基因LHPP

00 文章信息

「英文标题：The protein histidine phosphatase LHPP is a tumour suppressor」

「中文标题：组氨酸磷酸酶LHPP蛋白是一种肿瘤抑制因子」

「期刊：」《Nature》

「影响因子：」 42.778 「发表时间：」 2018-03-21

「研究领域：」 抑癌基因

「DOI号：」 10.1038/nature26140

01 文献概述

SUMMARY

组氨酸磷酸化，也就是所谓的隐藏的磷酸蛋白质组，是一种特性不佳的蛋白质翻译后修饰。我们描述了组氨酸磷酸化在肿瘤发生中的作用。在mTOR驱动的小鼠肝癌模型中对12种肿瘤的蛋白质组学分析显示，仅有的哺乳动物组氨酸激酶NME1和NME2表达上调。相反，假定的组氨酸磷酸酶LHPP的表达在肿瘤中特异性下调。我们证明LHPP确实是一种蛋白质组氨酸磷酸酶。与这些观察结果一致的是，在肝脏肿瘤中，整体组氨酸磷酸化水平显著上调。LHPP在肝细胞癌小鼠模型中的持续肝表达降低了肿瘤负担并防止了肝功能的丧失。最后，在肝细胞癌患者中，LHPP的低表达与肿瘤严重程度的增加和总存活率的降低相关。因此，LHPP是一种蛋白质组氨酸磷酸酶和肿瘤抑制因子，这表明失去调节的组氨酸磷酸化是致癌的。

02 文章背景

• 肝癌是全球癌症相关死亡的第二大主要原因。肝细胞癌（HCC）约占原发性肝癌病例的90％。最近的研究表明，几乎50％的HCC病例显示PI3K–AKT–mTOR信号异常
• 中国是肝病大国，同时也是肝癌大国。全世界50%以上的新发和死亡肝癌患者发生在中国。但事实上，因为紧邻胃肠道且需要过滤血液中很大一部分的抗原成分，肝脏的免疫环境非常特殊，免疫耐受尤为明显。而且很多肝癌患者一诊断出来就是晚期，肝脏已经严重受损，预后通常很差。寻找一种更早发现疾病的方法可以显着改善肝癌患者的前景。
• 样品的蛋白质组学分析

03 实验流程

• 蛋白质组学选择差异表达
• 从众多差异表达的基因里面定位到LHPP
• 实验验证
• 转录组表达数据验证
• LHPP基因突变情况

04 实验结果

• 几乎50％的HCC病例显示PI3K–AKT–mTOR信号异常，包括肿瘤抑制因子PTEN，TSC1和TSC2 的丢失
• L-dKO小鼠分别在6周和20周龄时分别表现出肝肿大和晚期肝肿瘤

• 组织病理学分析和基于肝癌标志物的mRNA的表达的CD133，CD90，CD44和ALDH1分析表明L-DKO肝脏肿瘤和低分化的人HCC具有相似性，也就是说在人低分化肝癌中表达的标志物在L-dKO小鼠中同样适用，说明这种小鼠可以用来模拟疾病

将来自六个cre阴性且年龄和性别匹配同窝的肝脏蛋白质提取物等量合并用作对照

• 确定了每个肿瘤大约4,500种蛋白质
• 与对照相比，在至少10个肿瘤中检测到433种蛋白质被上调，而262种蛋白质被下调

• 至少十种肿瘤中显著失调的已知或可能的磷酸酶和激酶

• LHPP从蠕虫到人类是保守的(总的28%的同源性)
• 但只与两个已定义的哺乳动物组氨酸磷酸酶PHPT1(8.1%的同源性)和PGAM5(6.4%的同源性)有弱的同源性

• L-dKO肿瘤中LHPP被下调，NME1和NME2被上调
• 对在Ser240和Ser244磷酸化的S6蛋白（S6-pS240 / 244）和在Ser473磷酸化的AKT（AKT-pS473）进行的免疫印迹分析分别证实了L-dKO肝组织和肿瘤中的高mTORC1和mTORC2活性
• 来自不同年龄和肿瘤发展不同阶段的L-dKO小鼠的全肝组织(6、12和16周)和分离的肿瘤(20周)

• (b)与非肿瘤肝组织相比，LHPP表达在肿瘤中减少（或不存在）

• (c)20周L-dKO小鼠肝脏的免疫组化证实，与非肿瘤组织相比，LHPP在肿瘤中被显著下调
• 与mTOR活性一样，NME1和NME2在肿瘤和非肿瘤L-dKO肝组织中的表达与对照肝组织相比也有类似的上调，这再次表明NME1和NME2的表达与mTOR活性有关，而与致瘤性无关

• NME1和NME2的表达是mTORC2依赖性的，而LHPP表达是mTOR依赖性的
• L-dKO肿瘤和对照肝脏中的组氨酸磷酸化（1-pHis和3-pHis）。与对照组织相比，肿瘤中1-pHis和3-pHis的免疫印迹信号均较高
• NME1和NME2通常会自磷酸化His118的N1位，然后将该磷酸转移到目标蛋白中的组氨酸（N1或N3）上。与NME1-pHis118和NME2-pHis118的水平升高和LHPP水平降低相一致，L-dKO肿瘤中组氨酸磷酸化显著增加。

• 重组LHPP降低了电泳分离的CB1细胞裂解液中转移到膜上的3-pHis水平
• 使用腺病毒递送系统恢复CB1细胞中LHPP表达，将3-pHis降低了3.1倍，对1-pHis，pSer / Thr或pTyr的影响可忽略不计
• 将小鼠LHPP引入人SNU449细胞后，pHis的结果相似

这些结果表明LHPP是广泛作用于N3-磷酸化蛋白的组氨酸磷酸酶

LHPP在CB1和SNU449细胞中表达的增加显著降低了细胞的增殖，在CB1细胞中减少了肝球的形成

相反，敲低SNU449细胞中已经很低的LHPP表达水平可促进细胞增殖

与AAV对照相比，AAV-LHPP感染后L-dKO肝肿瘤负荷减少（箭头表示肿瘤）。

通过免疫印迹证实了在AAV-LHPP感染的L-dKO小鼠（20周）的肝中LHPP的过表达

AAV-LHPP的L-dKO小鼠几乎没有小肿瘤

与感染AAV的人相比，感染AAV-LHPP的L-dKO小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT），天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）的水平降低。对照小鼠中未观察到有害作用。因此，LHPP的表达防止了L-dKO小鼠中的肿瘤形成并维持了肝功能，这表明蛋白组氨酸磷酸酶LHPP是一种肿瘤抑制因子。

与几例非肿瘤组织相比，L-dKO小鼠中LHPP在肿瘤（HCC）中较低，NME1和NME2在肿瘤中的表达较高。

与免疫印迹分析一致，免疫组化显示，与另外两名患者的相邻非肿瘤组织相比，HCC中LHPP表达低而NME1和NME2表达高

与匹配的非肿瘤组织相比，肝癌中LHPP的表达显著下调

从37名患者已发布的mRNA表达数据集与HCC的基础上，LHPP mRNA水平（不是PHPT1或PGAM5 mRNA水平）在肿瘤组织中相对于匹配的非肿瘤组织较显著

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以上发现表明在小鼠和人的肿瘤中组氨酸磷酸化均被上调。

根据生存分析可以发现，人HCC中LHPP表达的降低与组氨酸磷酸化的增加和存活率降低有关。

05 问题

1. 质谱

质谱(mass spectrum)是化合物分子在真空条件下受电子流的轰击或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带电荷的离子，这些离子按质荷比m/z(离子的质量m与其所带电荷z的比值)的大小被收集并记录成谱的方法。

生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术，其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子之间的荷质比(M/E) 的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解( 水解Lys或Arg的-C端形成的肽键)成肽段，对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱包括两种:基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾质谱( ESI- MS)。

2. LHPP

LHPP是一种从蛋白中去除组氨酸连接磷酸基团的磷酸酶。

• 与所有的氨基酸一样，组氨酸也是蛋白质的基本组成部分。由于缺少合适的工具，人们很少对蛋白质的组氨酸磷酸化作用进行研究。
• LHPP的缺失会增加整体蛋白质组氨酸磷酸化的作用，这会导致某些重要的功能被激活，以及细胞增殖不再受控制。也就是说，LHPP的缺失会肿瘤细胞毫无节制的生长。
• 研究人员们发现这种酶存在于健康组织中，肿瘤组织中几乎没有。于是研究人员重新引入LHPP的遗传信息发现，LHPP可防止肿瘤形成并保持肝功能。

3. 激酶、磷酸酶与磷酸化酶

「激酶」(kinase)是催化从高能供体分子(如ATP)转移磷酸基团到特定靶分子(底物)的酶，这一过程称之为磷酸化。因此，激酶本质上是磷酸转移酶(phosphotransferase)大家族的一部分。接受磷酸基团的可以是蛋白质、氨基酸、脂质、糖、核苷等受体(acceptor)化合物中的经基、羧基等。如果受体分子是多肽链氨基酸残基中的活性基团(通常为羟基)，一般将这些酶称为蛋白质激酶。蛋白质激酶是最大的激酶族群。根据酶的特异性不同，同一蛋白质激酶常可以有多个底物，一个蛋白质也可以是多个蛋白质激酶的底物。因此，蛋白质激酶常根据其调控因子来命名，如丝裂原活化蛋白质激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)。蛋白质激酶作用于特定的蛋白质，改变其活性，在细胞的信号传导及复杂的生命活动中具有广泛的作用。在酶学分类上，激酶属于转移酶类

有一类同样催化产物为磷酸化合物的酶加不是激酶，而称作为「磷酸化酶」(「phosporlaos」)。磷酸化酶催化添加一个来源于无机磷酸的磷酸基团到受体分子，如糖原磷酸化酶(glycogon phosphorylaso, EC 2.4.1.1)，其实是一个葡萄糖基转移酶。因此，它同样属于转移酶类，只是与激酶所属亚类不同。

还有一类与激酶相对应的酶称为「磷酸酶」(「phosphataso」)，是通过水解从供体分子中除去一个磷酸基团，因此，它催化的是一个 去磷酸化反应，其本质是一个水解酶(EC 3hydrolaso)。不过，也可把磷酸化酶催化的反应看作是一个磷酸解过程。

因此，理解一个酶的名称，不能仅仅根据催化反应中的某一个主要产物，应该熟悉酶的分类和命名原则，同时，了解酶促反应过程和机理，

4. 定量磷酸化修饰组学

「简介」

蛋白质磷酸化（Phosphorylation）是指蛋白质在磷酸化激酶的催化下，把ATP或GTP上的磷酸基转移到蛋白质的特定位点（氨基酸残基Ser、Tyr、Thr）上的过程。

磷酸化是一种广泛存在的翻译后修饰类型，细胞内有超过30%的蛋白质发生磷酸化修饰。因此磷酸化修饰是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。磷酸化参与各种生理和病理过程，调控细胞的增值、发育、分化、凋亡等生命活动，广泛运用在信号转导通路、细胞凋亡、发育分化、癌症机理等研究领域。

「技术原理」

首先将蛋白样本酶解成肽段混合物，然后使用液相色谱对酶解后的肽段混合物进行组分分离以降低样本复杂程度，然后通过高质量的磷酸化修饰类抗体和生物材料对修饰肽段进行富集，最后上样至液相色谱-串联质谱中进行分析定量。

「仪器设备」

Thermo Scientific Q Exactive HF-X

Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos

Thermo Scientific Q Exactive Plus

Thermo Scientific Orbitrap Fusion

Thermo Scientific Q Exactive

「技术优势」

高特异性的修饰类泛抗体；

高分辨率、高灵敏度质谱仪；

经验丰富的蛋白质修饰组研究团队。

高精度精确定量，通量高达10000以上。

「应用领域」

广泛运用在信号转导通路、细胞凋亡、发育分化、癌症机理等研究领域。

5. 生存分析图复现

library( "clusterProfiler" )
library( "org.Hs.eg.db" )
keytypes(org.Hs.eg.db)
library("stringr")
rownames( AssayData ) <- str_sub(rownames( AssayData ), start = 1, end = 15)
AssayData$ENSEMBL <- rownames( AssayData )
gene_name <- bitr( AssayData$ENSEMBL, fromType = "ENSEMBL", toType = "SYMBOL",
OrgDb = org.Hs.eg.db )
head( gene_name )
AssayData <- AssayData[gene_name$ENSEMBL, ]
gene_name$max <- apply(AssayData, 1, max)
gene_name <- gene_name[order(gene_name$SYMBOL,
gene_name$max,
decreasing = T), ]
gene_name <- gene_name[!duplicated(gene_name$SYMBOL), ]
AssayData <- AssayData[gene_name$ENSEMBL, ]
rownames(AssayData) <- gene_name$SYMBOL
AssayData[1:3, 1:3]
AssayData = AssayData[,1:ncol(AssayData)-1]
# 把样品名称变为一致
colnames(AssayData) = str_sub(colnames(AssayData), start = 1, end = 15)


tumor_sample <- colnames(AssayData)[substr( colnames(AssayData),14,15) < 10]
pheno = rownames(phenoData)[substr(rownames(phenoData),14,15) < 10]
fin_tumor = intersect(tumor_sample,pheno)
# 提取最终的表达矩阵和临床信息
AssayData = AssayData[,fin_tumor]
pheno_fina = phenoData[fin_tumor,]
AssayData = log2(AssayData+1)
save(AssayData, pheno_fina, file = './data/LHPP_step1.Rdata')
# 开始生存分析
library(ggrisk)
library(survival)
library(survminer)
# 先做无病生存期，首先把DFI不明（NA）的样本给去掉
DFI = pheno_fina[,c(1,2,7,8)]
dfi = DFI[!is.na(DFI$DFI),]
dfi_count = AssayData[,rownames(dfi)]
dd = scale(as.numeric( dfi_count["LHPP",]))
# 绘图
mySurv<-Surv(dfi$DFI.time, dfi$DFI)
dfi_group<-ifelse(dd <= -1 ,"low","high")
fi <-survfit(mySurv~dfi_group,data = dfi)
survminer::ggsurvplot(fi, data = dfi, risk.table = TRUE,
pval = T, )

# 接下来绘制os的
os = pheno_fina[,1:4]
os = os[!is.na(os$OS),]
os_count = AssayData[,rownames(os)]
dd = scale(as.numeric( os_count["LHPP",]))
mySurv<-Surv(os$OS.time, os$OS)
dfi_group<-ifelse(dd <= -1 ,"low","high")
fi <-survfit(mySurv~dfi_group,data = dfi)
survminer::ggsurvplot(fi, data = dfi, risk.table = TRUE,
pval = T, )

呐，等你关注都等出蜘蛛网了~