甲基化结合免疫浸润如何打造5分+SCI
题目：NEFM DNA methylation correlates with immune infiltration and survival in breast cancer
NEFM DNA甲基化与乳腺癌免疫浸润和生存的相关性
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摘要
背景：本研究旨在确定NEFM DNA甲基化是否与乳腺癌（BRCA）的免疫浸润和预后的相关性，并研究NEFM相关的免疫基因特征。
方法：使用Oncomine和TIMER数据库研究NEFM在BRCA和正常乳腺组织中的表达水平。使用TCGA数据库研究NEFM DNA甲基化与NEFM表达水平的关系。使用TCGA，The Human Protein Atlas和Kaplan–Meier plotter数据库研究NEFM DNA甲基化水平和表达水平对临床结果的潜在影响。使用TIMER和TISIDB数据库研究NEFM表达水平和DNA甲基化水平与免疫浸润的关系。
结果：NEFM高表达与OS和RFS较好有关，而NEFM DNA甲基化与OS较差有关。NEFM表达水平与DNA甲基化水平负相关。NEFM DNA甲基化与B细胞，CD8+ T细胞，CD4+ T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和树突状细胞浸润水平负相关，NEFM水平与巨噬细胞浸润正相关。NEFM表达水平和DNA甲基化水平与多种免疫标记物有关。
结论：NEFM低表达和DNA甲基化与预后较差有关。NEFM表达与巨噬细胞正相关。NEFM DNA甲基化与免疫浸润负相关。本研究鉴定了NEFM表达和DNA甲基化在肿瘤免疫微环境挑中中的潜在功能。
流程图
结果
1. 数据的获取和整理
从TCGA数据库下载TCGA BRCA DNA甲基化数据1226例，下载表达数据1223例。从TIMER数据库下载BRCA的免疫浸润数据。使用Oncomine数据库研究NEFM在各种癌症中的表达数据。
2. NEFM在癌症中的表达水平
使用Oncomine数据库分析NEFM在多种癌症肿瘤组织和正常组织中的表达水平。NEFM在大多数癌症中下调表达，包括脑组织，CNS，乳腺组织，结肠组织，胃等，而在膀胱，肺癌等中上调表达（图1a）。为研究NEFM在肿瘤组织和正常组织中表达水平的差异，使用TIMER研究多种恶性肿瘤中的TCGA转录组数据。与正常组织相比，NEFM在BLCA,BRCA,COAD,HNSC,LUAD等肿瘤组织中显著低表达（图1b）。
图1 NEFM在不同癌症中的表达水平
3. NEFM在癌症中的潜在预后作用
使用Kaplan–Meier plotter研究NEFM表达水平对泛癌种OS的潜在影响（表1和图2e-2r）。
表1 NEFM表达对泛癌OS的影响
NEFM高表达与胰腺导管腺癌，神经节瘤等OS较好有关。而与肾透明细胞癌，肺腺癌，胃腺癌和膀胱癌等的OS较差有关。对于BRCA来说，NEFM低表达与OS较差有关（图2a），NEFM蛋白表达水平与OS较好有关（图2b）。
图2 NEFM表达与泛癌的生存分析
单因素Cox分析表明临床分期，NEFM表达，年龄，ER，PR，HER2是OS的预后因素。多因素Cox分析表明临床分期，年龄和NEFM表达是OS的预后因素（表2）。进一步分析表明，NEFM高表达与BRCA预后较好有关（图2c和2d）。
表2 单因素和多因素Cox分析
4. NEFM DNA甲基化与NEFM表达水平负相关
对TCGA甲基化和转录组的数据进行研究表明，与正常组织相比，肿瘤组织中NEFM DNA甲基化水平较高（图3b-3d），而NEFM水平较低（图3a）。此外，有3个DNA甲基转移酶水平在NEFM高表达组和NEFM低表达组存在显著差异。NEFM低表达组中DNMT1,DNMT3A和DNMT3B的水平更高（图3e-3g）。乳腺癌中，NEFM DNA甲基化水平与NEFM水平负相关（图3h-3j）。
图3 NEFM转录水平和DNA甲基化水平的相关性
NEFM DNA甲基化水平与OS较差有关（表3）。单因素Cox分析表明,6个NEFM DNA甲基化与OS有关。
表3 单因素Cox分析
5. NEFM表达/DNA甲基化相关的基因和通路
将NEFM/NEFMmet高组和低组进行差异分析，研究NEFM表达和NEFM DNA甲基化相关的差异表达基因。NEFM表达差异分组中共有164个上调基因和546个下调基因。NEFM DNA甲基化差异分组中共有103个上调基因和641个下调基因（图4a和4d）。对排名前50的差异表达基因绘制聚类热图（图4b和4e）。随后对差异基因进行KEGG富集分析（图4c和4f）
图4 差异分析和KEGG富集分析
6. NEFM表达/DNA甲基化与乳腺癌免疫浸润的相关性
使用相关性分析和TISIDB数据库评估乳腺癌NEFM表达/DNA甲基化与免疫浸润的相关性。NEFM表达水平与巨噬细胞和中性粒细胞浸润水平正相关（图5a和5c）。NEFM表达水平与CD8+ T细胞，CD4+ T细胞浸润水平正相关，而TISIDB数据库中与活化CD8+ T细胞，活化CD4+ T细胞浸润水平负相关（图5a和5c）。由于相关性分析和TISIDB数据库分析的结果不同，作者使用TIMER基因模块评估乳腺癌中NEFM表达水平与免疫浸润的关系。TIMER基因模块中，NEFM表达水平与CD8+ T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和树突状细胞浸润水平正相关，而与B细胞浸润水平和肿瘤纯度负相关（图5b和5d）。NEFM DNA甲基化水平与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平呈中度到强烈的负相关。NEFM表达水平与M2巨噬细胞浸润水平呈弱负相关，NEFM DNA甲基化与M1巨噬细胞浸润水平呈弱负相关，与M2巨噬细胞浸润水平呈正相关(图5e)。
图5 NEFM表达水平/DNA甲基化与免疫浸润的相关性
7. NEFM表达水平/NEFM DNA甲基化与免疫标记物的相关性
使用TISIDB和TCGA数据库评估NEFM表达水平/NEFM DNA甲基化与免疫标记物的相关性。NEFM转录水平与ADORA2A、CSF1R、IDO1、KDR、LAG3、TGFBR1、VTCN1、C10orf54、CD276、CD40、CD70、ENTPD1、NT5E、PVR、TMEM173、TNFRSF13B、TNFRSF17、TNFSF4相关性较差，而与CXCL12和TGFB1相关性较强。NEFM DNA甲基化与免疫调节因子负相关（表4）。
表4 NEFM表达水平/NEFM DNA甲基化与免疫调节因子的相关性
此外，NEFM表达水平与MHC相关分子B2M和HLA-DPB1相关性较差（表5）。
表5 NEFM表达水平/NEFM DNA甲基化与MHC分子的相关性
NEFM表达水平与CCL14、CCL21、CXCL12、CXCL14、CCL28、CCR10和CX3CR1呈显著正相关。与CCL7、CCL8、CCL18呈显著负相关（图6）。
图6 NEFM表达水平/NEFM DNA甲基化与免疫标记物的相关性
结论
本研究作者基于TCGA数据库多种泛癌的表达数据和DNA甲基化数据研究NEFM表达水平与NEFM DNA甲基化水平和BRCA患者的预后和免疫浸润相关性。结果表明，NEFM表达水平与BRCA患者预后较好和巨噬细胞浸润水平正相关。NEFM表达水平与CD8+ T细胞浸润增加有关，而与B细胞浸润减少有关。NEFM DNA甲基化与BRCA患者B细胞，CD8+ T细胞，CD4+ T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和树突状细胞免疫浸润减少和预后较差有关。此外，NEFM表达水平/NEFM DNA甲基化与BRCA中多种免疫标记物和通路有关。作者的研究突出了NEFM表达水平/NEFM DNA甲基化在乳腺癌中的潜在临床意义。本研究还存在一定局限性，应该对本研究结果进行相应的实验验证。