文献阅读 · 变异分析流程--肿瘤基因组测序数据分析专栏

• 可以确定同一位点每个样本的基因型。
• 直接推断以确定先证者中的两个杂合位点是顺式还是反式。
• 可以减轻突变位点的差异问题，避免复杂突变可能存在不准确的问题。

call 突变的工具推荐使用GATK HaplotypeCaller 和 Platypus。也有基于贝叶斯统计方法的 Samtools/BCFtools 和 FreeBayes 。不同工具得到的结果的一致性通常在 90% 以上。 过滤 Artifacts 虽然从上面方法得到的突变结果准确度高达 99.9%，但是依然会由于人为因素而引入了假阳性突变。因此，得到的突变结果需要在 IGV 中进行人工手动的可视化过滤。如：低质量碱基（图 2 a），reads末端的artifacts（图 2 b），由于局部比对错误引起的插入缺失（图 2 c），strand bias artifacts（图 2 d）、低复杂度区域中的错误比对（图 2 e）等 识别de novo mutations 在人群中，de novo mutations 存在一定的频率。可以基于已经公开的数据集，如 gnomAD 进行注释和过滤。一般认为在人群中 MAF > 0.0001（也有人说是0.001），更有可能是 germline mutation。 拷贝数和结构变异 拷贝数变异 CNV 是人类遗传变异的另一种类型，与许多疾病相关，如抑郁症 autism，智力底下 intellectual disability，先天性心脏病 congenital heart disease。NGS 在临床上也有应用于 CNV 检测，相应的工具有：cn.MOPS 、CONTRA、CoNVEX、ExomeCNV、ExomeDepth 和 XHMM。如果是全基因组测序，还有检测结构变异 SV，常用的软件有 DELLY 、Lumpy 、Manta 、Pindel 和 SVMerge ，但由于二代测序的 reads 读长较短，检测 SV 仍然存在挑战性。 拷贝数变异和 SV 可以通过 IGV 进行可视化查看：

• 如A图中先证者存在约 4kb 的杂合 del，而母亲在这个位置都没有 reads 覆盖，则是纯合缺失，父亲正常。
• B图则显示两个亲本都是杂合缺失，先证者是纯合缺失
• C图父亲和先证者都是杂合缺失
• D图覆盖深度上可以看到绿色的reads显示先证者和母亲存在的串联重复

由于短读长测序在检测 SV 上的准确性只有0.8~0.9，因此，对于 SV 变异，可以基于“黄金标准”参考数据集进行验证，已有多个 SV 数据集发布：GIAB 、HS1011 和 HuRef 。 Somatic mutation 的分析最佳流程 对于体细胞突变 Somatic mutation，应用最多的便是肿瘤研究。临床上更关心的是体细胞突变、拷贝数变异和融合基因等与临床表征是否相关，通常需要肿瘤-正常样本配对进行分析。 call 突变 使用最广泛的工具是 Mutect2 ，Strelka2，VarScan2 ，采用 肿瘤和正常配对的模式，一般结合两个或多个工具可以得到较好的结果。 但是由于临床样本存在肿瘤纯度的问题，且存在亚克隆突变导致很多体细胞突变频率较低，使得难以检测出来。还有就是临床样本很多是 FFPE 样本，存在 DNA 损伤，造成各种假阳性，对检测工具来说都是具有挑战性的。 体细胞突变的过滤

• 与 germline mutation一样，需要在 IGV 进行可视化过滤，人工手动筛查，基于 tumor 和normal 的 bam 文件
• 人群数据库过滤，如dbSNP 和 gnomAD ，不能一刀切过滤掉 dbSNP 数据库中的所有位点，因为该数据库包含许多来自人类肿瘤的重复突变——例如PIK3CA 的 p.(H1047R) (rs121913279) 和IDH1 的p.(R132H) （ rs121913500）。作者建议以 GnomeAD 或 TopMed 数据库注释的 minimum minor allele frequency > 0.0001 作为过滤的阈值。前文也提到过这个阈值，同样也有人建议 0.001 。
• 基于一组正常样本（通常是50个）的 PoN（Panel of Normal） 进行过滤：这有利于排除掉 germline mutation 和由于实验或测序技术造成的 artifacts。
• 肿瘤和正常样本在突变位点的 reads 覆盖度 > 10x

体细胞拷贝数变异 对于体细胞拷贝数变异 SCAN 分析，同样也是建议使用多个工具结果，如 GATK 和 VarScan2 ，分析过程中纳入 VAF 可以为体细胞拷贝数变异提供支持证据。同样采用正常人群的 PoN 可以提高结果的准确性。 评论 文章作者仅仅是阐述了从原始的 fastq 文件到得到变异结果即 vcf 文件或拷贝数变异的 segment 文件的过程以及涉及到的工具。而实际上，我们得到突变结果之后还要对突变进行注释，基于注释结果的过滤。过滤之后还有更多分析，如肿瘤异质性、TMB评估、克隆分析、突变特征分析 Mutation Signature、肿瘤纯度评估、驱动突变的推断、MSI 评估、新抗原预测等。 这些分析和可视化用到的众多工具或R包，其安装方法和使用方法都有一定难度。本系列文章的后续推文，将就这些分析进行文献解读和工具使用方法介绍。