人、猕猴、小鼠静息态三重网络
三重网络模型是Vinod Menon 2011年基于静息态功能连接提出的用于评估人类神经精神疾病的理论模型。该模型认为静息态功能网络中突显网络、默认网络、中央执行网络对神经精神疾病评估具有重要意义。数十年来，该模型在多项疾病研究中得到验证，但受限于人体的非侵入性，极少有研究能深入到神经元层面探讨三重网络的结构功能基础。本研究利用大脑转录组信息整合了人、猕猴、小鼠脑功能网络，发现小鼠、猕猴大脑也可以用三重网络模型来描述。本实验进一步探究了类抑郁动物模型、神经元结构环路、光遗传功能网络与三重网络的相关性，从神经系统构成机制上对三重网络进行了验证。实验再次证明了三重网络的应用价值，同时为动物研究结果向人类转化提供了范式。本文发表在Molecular Psychiatry杂志。
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摘要：
三重网络模型是一种用于描述精神疾病结构、功能特征的理论框架。该模型认为大脑中存在三个特征网络：突显网络（salience）、默认网络（default-mode）和中央执行网络（central executive），三者之间的内在和相互联系与患者的大脑功能紊乱有关。虽然类似的网络模型在动物模型上也被提出，但未很好整合至三重网络模型中。作者认为人、猕猴、小鼠的三重网络具有类似的时空特性，三重网络模型同样可以用于动物类抑郁模型解释。实验利用数据驱动思路将小鼠静息态功能网络映射到人脑标准图谱上，在此基础上发现动物病毒示踪技术显示结构网络和光遗传激活网络、人脑纤维追踪网络均有较好的对应关系。实验还发现血清素系统和突显网络之间的关系比默认网络更加密切。实验证明了人、小鼠具有类似的三重网络特征，两者具有类似的疾病模型特征。实验构建了一种人源化动物大脑网络的方法，可以用于动物实验结果向人脑转化。
文章思路：
- 直接比较人、猕猴、小鼠静息态功能网络，探究猕猴、小鼠中是否存在类似三重网络的网络特征。
- 利用全脑转录组信息将小鼠脑功能网络映射到人脑图谱上，比较小鼠静息态数据在空间、时间上和人静息态数据的相似性。
- 在原位小鼠脑上研究三重网络和病毒示踪（显示神经元结构连接）、光遗传fMRI（显示神经元功能连接）之间的关系。
实验方法：
- 文章主要采集了小鼠（麻醉状态）、小鼠（清醒状态）、小鼠（慢性抑郁模型）、小鼠（光遗传激活状态）、猕猴（麻醉状态）数据，其余数据均从公开数据集获取。
- 其中小鼠（清醒状态）、猕猴（麻醉状态）数据质量较差，文章对数据做了大量的清洗工作。
- 实验主要对小鼠的三重网络进行了深入探究，如抑郁模型、光遗传fMRI等。虽然猕猴脑网络特征与人类也较为相似，但由于动物珍贵未进行后续侵入性实验。
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实验1：人、猕猴、小鼠静息态网络特征分析
数据采集：
小鼠静息态（麻醉状态）：麻醉（0.5%异氟烷+0.05 mg/kg美托嘧啶首注+0.1 mg/kg美托嘧啶维持），9.4 T，TR = 1 s，360 帧。无造模47只，慢性抑郁造模25只, 慢性抑郁模型对照组27只。
小鼠静息态（清醒状态）：11.75 T，TR = 1.2 s，180 帧，数量54只
猕猴静息态（麻醉状态）：麻醉（1%异氟烷），3T， TR = 0.78 s，1600 帧，雄性10只
人脑静息态数据：S1200数据库，清醒睁眼，7T，TR = 0.78 s，900帧
数据预处理：
小鼠、猕猴结构像数据处理：B1场校正（N4BiasFieldCorrection)；去噪（DenoiseImage）；剥头皮（antsBrainExtraction.sh）；配准（ANTs）至模板（小鼠脑AIBS模板，猕猴脑F99模板）
小鼠、猕猴静息态数据处理：时间层校正（3dDespike)；头动校正（3dvolreg）；B1场校正（N4BiasFieldCorrection)；去噪（DenoiseImage）；剥头皮（antsBrainExtraction.sh）；配准至结构像；滤波（3dBandpass, 小鼠0.01–0.25 Hz，猕猴0.01–0.10 Hz）
数据计算及清洗：
预处理后数据使用TbCAPs 工具箱计算共激活区域（CAPs）。
由于部分静息态数据波动较大，实验对数据进行了清洗，清洗条件有以下两个：
1) 使用TbCAPs 工具箱计算后共激活区域至少包含以下区域：岛叶、前扣带回、背外侧前额叶（人）；额叶视区（猕猴）；初级运动皮层（小鼠）
2）位置偏差 < 0.5 mm（猕猴，人）；< 0.2 mm（小鼠）
筛选后帧数：小鼠静息态（麻醉状态）保留80.4%（73.9%~85.3%）；小鼠静息态（清醒状态）保留35.8%（(1.1%~76.7%）；猕猴静息态（麻醉状态）19.0%（0.1%~ 53.9%）；人静息态（清醒状态）保留73.7%（65.9%~83.0%）
特征聚类：
使用80%的volumes对小鼠（麻醉），猕猴和人数据进行一致性聚类估计最佳K-Mean聚类维度。结果显示最佳维度小鼠为6、猕猴为5、人为6，故最终统一选择6个维度进行比较。
结果及分析：
为了比较人、猕猴、小鼠三者之间静息态功能网络，首先需要减少三者之间的差异。实验中，人数据使用7T（n=15）人脑连接组数据集，猕猴使用自由呼吸动物（n=10），小鼠使用机械通气动物（n=47）。实验首先根据大脑的时空特征将人、猕猴、小鼠的大脑划分成了6种状态。之所选择6种状态是因为小鼠的数据集在这样划分表现最优。并且这样的划分和大脑的空间结构无关，是完全数据驱动的，可以在没有精准定位的情况下进行比较。实验在不同动物个体上观察到了类似的空间模式（补充材料图1）。这些状态和默认网络（state #1，2，3）、突显网络（state #5，6）、中心执行网络（state #1，2，4）之间在小鼠后皮质网络中有着重叠的区域。其中state 3和默认网络的特征一致，包括前后扣带区域（ACA，PCA）以及后海马结构（rHPF）的共激活。
补充材料，图 1 人类(N = 15，左)、猕猴(异氟醚麻醉，N = 10，中)、小鼠(美托咪定/异氟醚麻醉，N = 47，右)的大脑状态。通过K-means聚类将静息态数据分割成6种状态，根据脑区特征和信号特征将人、猕猴、小鼠脑功能网络进行对比分析。
图 1 a 展示state #3 在人、猕猴、小鼠上的网络特征
实验还比较了麻醉状态和清醒状态小鼠的网络模式，其中state1、2、4有着较高的相似性。其他几个状态虽然变化模式与麻醉状态类似，但整体上看共激活区域较为散乱，可能和麻醉状态动物头动较大有关。同时，这个结果也说明不同麻醉状态下静息态数据经文章的计算处理方法处理后较为稳定，均可得到类似三重网络的分类结果。
补充材料，图 2 小鼠麻醉状态（左）和清醒状态（右）网络特征
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实验2：鼠脑人源化及特征分析
数据获取：
小鼠原位转录组数据库：Ensemble Biomart；Allen Brain Atlas数据库（Lein ES, Hawrylycz MJ, Ao N, Ayres M, Bensinger A, Bernard A, et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 2007;445:168–76）
人脑原位转录组数据库：Allen Brain Atlas数据库（Hawrylycz MJ, Lein ES, Guillozet-Bongaarts AL, Shen EH, Ng L, Miller JA, et al. An anatomically comprehensive atlas of the adult human brain transcriptome. Nature. 2012;489:391–9.）
数据处理：
从Desikan Killiany atlas图谱上获取了人脑81个脑区，小鼠全脑共3218个基因，根据表达丰度标准化至0-1。通过一个线性模型将小鼠脑特征网络作为线性叠加只标准化的原位转录组图谱中，根据3218个基因的转录信息将小鼠脑叠加至人脑Desikan Killiany atlas图谱上。
Meta 分析：
使用neuroquery进行抑郁模型网络特征分析，关键词‘depression’（检索时间10/07/2020），‘positive valence’（检索时间09/06/2020）。共返回78条检索结果，通过neuroquery工具箱显示重叠区域，使用默认阈值进行结果展示。
结果及分析：
实验首先根据原位杂交数据将小鼠特征网络映射至人脑模板上。通过将小鼠脑图转换为原位杂交脑图的加权因子，并将加权因子应用于同源的人脑基因转录数据，生成人源化小鼠脑特征图。人源化的小鼠脑特征图和人脑特征图具有较好的相似性（图1 b c，state #3 人源化状态，相似度0.56 [0.38,0.75]）。将所有6种特征图进行比较也可以发现具有对应关系的特征图具有更高的相关性（Cohen d = 0.72 [-0.02, 1.75]）
图1。b：人脑state #3 网络特征，人源化鼠脑state #3 网络特征；
c：相关性
补充材料，图 S3： a) 人脑6种状态之间的相关性；
b) 人脑6种特征图与人源化鼠脑6种特征图之间的相关性。
c) 比较完全对应特征图（#1-#1, #2-#2，#3-#3……）和不完全对应特征图（#1-#2，#1-3，#1-#4……）之间的相关性。
实验将6种特征图返回成时间序列，直接比较人、猕猴、人源化小鼠6特征图的转移概率，发现不同物种对应特征的转移概率较高相关性（图1 d e, 人-小鼠|相关性0.63 [0.36, 0.90], 猕猴|小鼠相关性0.61[0.33, 0.88]），说明不同物种的时间序列也具有较好的一致性。
图1 d 小鼠转移概率矩阵图
e 人、猕猴、小鼠转移概率的相关性
在确定人、猕猴、小鼠具有类似三重网络的基础后，文章尝试利用三重网络预测动物疾病模型特征。实验先利用Meta分析构建了抑郁人群的脑特征图（补充材料，图S4），其中前后扣带区（ACA，PCA）和岛叶（AI）区域变化明显，它们分别属于默认网络和突显网络。所以推测抑郁模型小鼠的默认网络和突显网络也都会受到影响。实验比较了慢性社交压力小鼠（CSS组，25只）和正常小鼠（control组，27只）的特征图。结果发现小鼠的默认网络（state #3）特征分析中，CSS（社交压力）组比对照组进入次数更多（图1 f，CSS-control Cohen’s d = 0.80 [0.21, 1.38]）。而去激活突显网络（state #6），CSS组比对照组进入次数更少（CSS-control Cohen’s d = -0.58 [-1.15, 0.06]）。结果说明抑郁模型小鼠三重网络特征和人脑三重网络特征具有类似的变化模式。
补充材料，图S4 Meta分析预测的抑郁症人群的脑特征图
图1f 小鼠慢性社交压力组（CSS）和对照组（control）六种特征图的比较
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实验3：小鼠神经环路与三重网络特征之间的关系分析
数据获取：
小鼠病毒示踪结果来源于Allen Brain Atlas数据库
数据处理：
使用Allen脑科学研究所应用程序编程接口从数据库中获取了498副顺行病毒示踪图谱（C57BL/6 雄性小鼠）。使用R 语言“nat”和“oro.nifti”包将图谱转换为 NIFTI 格式。实验通过提取一个种子点对应的所有对侧的注射区域信息建立投射图谱，并将该特征与所有像素点进行交叉引用。这样有效地揭示了相似种子区域的投射区域，而不是单纯比较单个种子区域的投射区域。
结果及分析：
脑特征图和功能网络理论上是建立在结构网络基础上的。病毒示踪剂具有更高的组织分辨率是结构网络探究的金标准，但无法直接应用于人脑研究。文章试图探究三重网络的结构特征。实验根据顺行病毒示踪结果建立了输入图谱，该方法可以更直接的和基于种子点的功能成像结果进行比较。实验分别以前扣带回（ACA）、岛叶（AI）、初级运动皮层（MOp）为种子点进行分析，这些种子点分别对应默认网络、突显网络、和侧向皮质网络。结果显示这三个网络分别锚定在不重叠的皮质和皮层下区域。这些结构网络和功能网络图谱具有类似的模式，说明三重网络具有一定的结构基础。
图S6。a、b)表示与岛状区域(AI，星号)相关的结构和功能连接揭示了小鼠突显网络。包括伏隔核(ACB)、岛叶区(AI)、丘脑内侧核(MD)、杏仁核(AMG)和中缝背核(DR)。结构连接是利用投影输入相似性确定的。
c、d) 表示与前扣带区(ACA，星号)相关的结构和功能连接，揭示小鼠默认网络。包括前边缘区(PL)、背侧纹状体(dSTR)、岛叶区(AI)、丘脑背外侧核(LD)、未定带(ZI)、视觉区(Vis)、海马形成区(HPF)和中缝上核(CS)。
e、f)表示与初级运动区(MOp)相关的结构和功能连接揭示了与初级躯体感觉区(SSp)、外侧纹状体(lSTR)和丘脑腹后核(VP)的协同活动。ACA表现出显著的负相关性。另外，功能性网络比结构性网络面积更广可能与功能性MRI捕捉到的多突触事件有关
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实验4：光遗传激活网络与三重网络特征之间的关系分析
光遗传fMRI数据获取：
病毒注射，性别混合小鼠（~14-18 周，~25 g）使用氯胺酮/赛拉嗪混合麻醉（氯胺酮 75 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg）。使用三块 Betadine® 和乙醇 (70%) 擦拭和清洁头皮组织。使用利多卡因进行局部麻醉，通过加热垫保持正常体温。将头部固定在脑立体定位注射装置中，使用眼用凝胶保持眼部湿润。移除部分头皮暴露颅骨，使用牙科钻（尖端Ø 0.9 mm2）在颅骨上开孔。注射携带光遗传元件病毒载体AAV5-CaMKIIa-hChR2(H134R)-mCherry (N = 10, 0.75 μl, 滴度1–8 × 1012 vg/ml，) 或对照病毒载体AAV5-CaMKIIa-mCherry (N = 8) ，注射位点左侧无颗粒岛叶（AI区，前-后 +1.8 mm，中间-横向 +2.5 mm，背-腹 -2.0 mm）。埋置光纤套管（Ø 200 μm，0.39 NA，Ø 1.25 毫米陶瓷套圈）至病毒注射区域上方，使用牙科水泥固定。手术后给予丁丙诺啡，在温暖的垫子上等待动物恢复。
ofMRI数据采集，动物先使用4%异氟醚诱导麻醉然后进行气管，使用机械通气（90 breath/min）。皮下混合注射美托咪定和泮库溴铵注射剂 (首注0.05 mg/kg，维持0.1 mg/kg/h)，调节异氟醚浓度至 0.5%。使用水浴动物床维持动物体温至 37°C。磁共振仪器，场强11.75 T (Bruker BioSpin MRI, Ettlingen, Germany)，B-GA09S梯度系统，72 mm 线性体积谐振器线圈，10 mm的单环表面线圈，操作系统Paravision 6.0.1。结构像使用自旋回波 Turbo-RARE 序列：视野 (FOV) = 17 × 9 mm²，饱和带，片层 = 21，层厚 = 0.45 mm，层间距 = 0.05 mm，采集矩阵 (MD) = 200 ×100，重复时间 (TR) = 2742 ms，回波时间 (TE) = 30 ms，RARE 因子 = 8，平均数 = 2。fMRI使用GE-EPI序列：采集矩阵 (MD) = 60 × 30，TR = 1000 ms，TE = 11.7 ms，翻转角 = 50°，帧数 = 720，带宽 = 119047 Hz，位置与结构像一致。使用 Map-shim校正场不均匀性。
ofMRI任务态，ChR2通过蓝光激发（473 nm，LaserCentury，上海激光光学世纪有限公司；~12–15 mW 输出）。Block设计：（50 s基线+10 s/20 Hz/10 ms光脉冲+50 s刺激后等待时间）*10 + 60 s刺激后等待时间。
ofMRI数据处理，预处理步骤与静息态一致，高通滤波（0.01 Hz），独立成分分析（melodic）；去除协变量（fslregfilt）
结果与分析：
实验比较了岛叶区ofMRI激活网络和三重网络之间的关系应。结果显示ofMRI激活岛叶CamKII神经元区后，脑血容量（CBV）和BOLD多个脑区均出现了明显的变化（图 S7a b），CBV与BOLD信号变化模式相近。并且岛叶区域（原位）BOLD信号在激光刺激时也出现了明显的变化（图 3c）。
实验进一步将病毒示踪结构网络与光遗传功能网络进行比较。实验分别以ACA、aAI 和 MOp 种子建立的默认网络、突显网络和侧皮质网络的结构网络图谱，与光遗传激活网络（CBV，BOLD）进行线性比较。结果均显示CBV和BOLD信号与AI相关的结构环路相关性更高。说明光遗传激活岛叶区域显示的功能网络和AI区域相关的结构网络有较高的相似性。
图3 岛叶区域的ofMRI。
a 光遗传激活位点；
b 激光刺激时ChR2 (N = 10) 相对于 mCherry (N = 8) 显著变化的区域；
c 岛叶区域平均BOLD信号响应（Mean+SD）；
d ChR2组和mCherry激活区位置差异；
e BOLD信号与 ChR2 注射小鼠的位置偏好关系；
f 后扣带回区的 BOLD 出现变化的情况；
g Meta分析结果，关键词‘positive valence’
图 S7。 a) 激光刺激时ChR2 (N = 63) 相对于 mCherry (N = 18) 脑血容（CBV）显著变化的区域。
b) 激光刺激时ChR2 (N = 10) 相对于 mCherry (N = 8) 显著变化的区域
c) 结构网络与功能网络的比较，分别以ACA、aAI 和 MOp 种子建立的默认网络、突显网络和侧皮质网络的结构网络图谱，与光遗传激活网络（CBV，BOLD）进行线性比较。TraceraAI ~ CBV 相关性 0.20 [0.09, 0.30]），TracerACA ~ CBV 相关性0.14 [0.04, 0.23])， TraceraMOp ~ CBV 相关性 0.01 [-0.09, 0.11]）。d) TraceraAI ~ BOLD 相关性0.24 [0.14, 0.35]），TracerACA ~ BOLD相关性0.02 [-0.07, 0.12])， TraceraMOp ~ BOLD相关性 0.08 [-0.02, 0.18]）
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总结：
1）本实验基于磁共振静息态数据构建了人、猕猴、小鼠的脑特征图谱，该特征图谱与人脑三重网络理论有着较高的一致性，说明三重网络也可能应用于猕猴、小鼠疾病模型研究。
2）实验构建了一种人源化鼠脑特征图的方式。通过小鼠和人脑原位转录图谱，将小鼠脑特征图谱映射到人脑模板上，方便动物研究结果的转化。
3）实验利用人源化小鼠脑特征图的方法，将小鼠抑郁模型的脑特征图人源化和人脑抑郁模型直接比较，证明了小鼠抑郁模式也可以通过三重网络解释。
4）实验证明了小鼠病毒示踪结果与三重网络特征之间具有较高的相关性。
5）实验证明了岛叶激活的ofMRI与三重网络中图像网络有较高的相关性。