Science | 肿瘤浸润性T细胞的泛癌单细胞图谱

编译 | 姜晶 审稿 | 任宣百

本文介绍由北京大学的季加孚教授研究团队和张泽民教授研究团队合作发表在 Science 的研究成果：联合研究团队首次为来自21种癌症类型的316名患者构建了一个单细胞RNA测序泛癌T细胞图谱，并揭示了不同的T细胞组分模式。作者发现CD8+T细胞耗竭的多个状态转换路径以及这些路径在不同肿瘤类型中的偏好。某些T细胞群显示出与患者特性(如突变负荷)的特异相关性，阐明肿瘤微环境的可能决定因素。仅肿瘤内的T细胞组分就可以将癌症患者分为具有临床特征特异性的组，为T细胞免疫和靶向T细胞的精准免疫治疗提供新的见解。

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简介

肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)是肿瘤微环境(TME)的核心参与者，塑造了基本的临床特性，例如对免疫疗法应答。免疫检查点阻断(ICB)在临床上应用很成功，但其疗效在不同癌症类型间会有所不同，这表明肿瘤免疫存在潜在差异。在TME内，效应T细胞多个抑制性受体表现出高表达，例如PD-1、TIM3、TIGIT和LAG3，它们被认为是功能失调状态(T细胞衰竭)的标志。ICB功效的不同与不同癌症类型下的肿瘤浸润T细胞状态差异有关，尤其是耗竭差异。在黑色素瘤患者中，CD8+肿瘤浸润T细胞从功能障碍前细胞状态到功能障碍表现出一个线性和连续进展，但在肺癌患者中，有两种可能发展为衰竭的预衰竭状态。因此，各种癌症的TME之间的耗竭动态可能不同。从本质上讲，T细胞耗竭受到几种转录因子(TF)的严格调控，包括TOX和TCF7，以及在功能失调CD8+ T细胞中观察到的塑造特定状态的表观遗传调节子。此外，多种TME因素导致耗竭表型，并且决定T细胞表型和丰度的不同调控过程可能存在于各种癌症类型的TME中。在不同的癌症类型中观察到了可分辨的T细胞特征，例如，肝癌和结肠癌的T细胞耗竭比例高于肺癌，多发性骨髓瘤等癌症类型没有显着的耗竭T细胞群。然而，直接比较研究被限制在三或四种孤立的癌症类型。

作者通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)在21种不同的癌症类型中构建了一个全面的肿瘤浸润T细胞概要。通过发现肿瘤浸润性T细胞的共性和差异，本文旨在揭示T细胞状态、动力学和调控的“泛癌”特征。

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结果

T细胞泛癌单细胞转录组图谱的构建

作者编译了21种癌症类型的T细胞单细胞转录组图谱(图1A)。经过严格的质量控制过滤后，该图谱的数据包含来自316名供体的397,810个T细胞 (来自他们的肿瘤、相邻正常组织和外周血)，其中46.4%的细胞是本研究新测序的，而其他则来自之前发表文章中的数据集。作者整合了多种技术产生的不同数据，视觉和定量评估均表明细胞在整合数据中混合良好。个体细胞的T细胞受体(TCR)序列被组装成通过10x VDJ和Smart-Seq2协议生成的数据。来自87个供体的15种癌症类型的92,533个克隆型的总共168,901个细胞包含至少一对TCR α链和β链，其中53.9%是克隆细胞(在至少两个细胞中发现相同的TCR对)，对应于14,631个扩展克隆型。

总共识别了17个CD8+和24个CD4+元簇，至少由80%的癌症类型共享(图1B和C)。这些元簇的表达特征分析揭示了先前描述的T细胞亚型和新细胞类型的存在，包括颗粒酶K阳性(GZMK+)效应记忆细胞(Tem细胞)、终末分化效应记忆或效应细胞(Temra细胞)，以及CD4+和CD8+区室中的干扰素刺激基因(ISG)-阳性T细胞；杀伤细胞免疫球蛋白-如受体(KIR)-阳性自然杀伤(NK)-如T细胞、ZNF683+CXCR6+组织驻留记忆T细胞(Trm细胞)和CD8+区室中的四个耗竭CD8+T细胞(Tex细胞)群；和三个滤泡辅助性T细胞(TFH细胞)和CD4+区室中的四个调节性T细胞(Treg细胞)群。

未经治疗的患者的不同起源组织的T细胞组分表现出显着差异，利用香农平均性指数测量多样性，在正常组织和肿瘤中的多样性显着高于血液中，而对于CD8+T细胞，肿瘤中的多样性高于正常组织中的多样性(图1D和E)。肿瘤中的CD8+细胞以出现耗竭T细胞为特征(图1D)，而在CD4+T细胞群中，丰度最高的是TNFRSF9+ Treg细胞群，其在血液和正常组织中的频率均显着降低(图1E)。

为了区分对肿瘤有反应的T细胞和旁观者T细胞，作者共同分析组织分布、转录表型、增殖和克隆扩增的特征。富含肿瘤的T细胞的增殖和克隆扩增特征已被视为肿瘤反应性的证据。从优势比(OR)分析来看，幼稚T细胞和Temra细胞(CD4+和CD8+)在血液中表现出强烈的分布偏好，而TNFRSF9+ Treg细胞、TFH/TH1细胞、CD8+ISG+T细胞和四个CD8+Tex细胞群似乎在肿瘤上富集(图1F)。在STARTRAC(通过RNA-seq和TCR追踪进行的单T细胞分析)分析的基础上，这种肿瘤富集的元簇表现出扩张和持续增殖(图1G)，暗示它们的克隆扩增对肿瘤抗原的反应。同时，CD4+和CD8+区室的Temra细胞在所有组织中均表现出显着的扩增，但增殖率较低(图1G)。量化组织迁移程度的STARTRAC迁移指数显示，在大多数测试的癌症类型中，CD8+和CD4+Temra细胞在血液与正常或肿瘤组织之间的迁移率最高。这些观察结果表明，这些T细胞在肿瘤外被激活和扩增，并在血液中循环。

总之，出现了潜在的肿瘤反应性T细胞-TFH/TH1细胞、TNFRSF9+ Treg细胞、CD8+ISG+T细胞和四种Tex细胞群，代表了局部抗肿瘤免疫反应-而扩增的CD8+Temra细胞也可能含有肿瘤特异性TCR，这与全身免疫反应的概念一致。

图1 单细胞下的泛癌T细胞谱

CD8+Tex细胞异质性和动力学的共同主题

在CD8+区室中，主要的潜在肿瘤反应性元簇是四个CD8+Tex细胞群，都高度表达多种耗竭标志物，包括TOX、TIGIT、CTLA4和TNFRSF9，但它们在基因表达和通路活性方面不同(图2A)。作者结合基因表达和TCR数据来剖析T细胞耗竭的轨迹，推断出从初始细胞到Tex细胞的两条路径：第一条路径(P1)通过GZMK+Tem细胞[原始细胞到IL7R+记忆T细胞(Tm细胞)到GZMK+T细胞到终端Tex细胞]，第二条路径(P2)通过ZNF683+Trm细胞(原始细胞到IL7R+Tm细胞到ZNF683+CXCR6+Trm细胞到终端Tex细胞)(图2B和C)。在单个肿瘤中也可以观察到从两条路径到Tex细胞的状态转变。尽管某些肿瘤表现出优先使用P1或P2，但在其他肿瘤中，这两条路径的状态转换都很高，这意味着Tem和Trm细胞都参与了这些肿瘤的抗肿瘤免疫。这里，作者证明了一种更复杂的T细胞耗竭细胞通路。

不同癌症类型中T细胞耗竭的不同途径

为了测试癌症类型中主要衰竭路径的流行率，作者通过癌症类型对TCR共享进行了分层。在末端Tex细胞和其他元簇之间具有强TCR共享的12种癌症类型中的11种中，末端Tex细胞与GZMK+Tex细胞、ZNF683+Trm细胞或P1或P2中的其他元簇表现出高pTrans值(图2D)，暗示P1和P2作为T细胞耗竭的通用路径。作者还观察到，在某些癌症类型中，末端Tex细胞和不在P1或P2中的元簇之间存在强烈的TCR共享(图2D)。这些TCR共享模式表明，除了通过Tem和Trm细胞的共同路径外，还存在导致T细胞耗竭的异质路径。

除了簇间TCR共享之外，终端Tex细胞和其他细胞群之间的联系可以通过终端Tex细胞中非耗竭状态的部分特征表达来证实。卵巢癌的一个末端Tex细胞子集表达了Treg细胞主导的TF FOXP3(图2E)，这些CD8+FOXP3+T细胞倾向于与表达CXCL13的细胞共享TCR，这意味着CD8+FOXP3+T细胞和CXCL13表达细胞之间的簇内转换。同样，卵巢癌末端Tex细胞的一个子集表达KIR2DL3和TXK，它们是KIR+TXK+T细胞的标志基因(图2E)，并且这些细胞与表达CXCL13细胞共享TCR。

作者进一步识别末端Tex细胞中具有癌症类型偏好的基因，包括IL26、IL17A和RORC。这些基因主要在CD4+TH17细胞或CD8+Tc17中表达。作者证实了它们在Tc17中的表达，但在食管癌、鳞状细胞癌和胃腺癌的某些肿瘤中，它们也在一部分终末Tex细胞中表达，尤其是IL26(图2F和G)。

CD8+T细胞耗竭的普遍和癌症类型特异性转录调控

识别TOX为T细胞耗竭的关键TF，激发了人们对寻找其他调节子的兴趣。作者系统地识别与耗竭相关的TF。编码TF的末端Tex细胞的标志基因在>80%的癌症类型中具有显着高表达，被指定为通用Tex细胞调节子。TOX、TOX2、RBPJ、ZBED2、PRDM1、VDR、IKZF4、BATF、STAT3和IFI16按效应大小排名，作为前10的通用TFs (图2H)。例如，TOX在所有癌症类型中都显示出统计学显着性。此外，重建调节子(TF及其靶基因)的SCENIC分析确定了靶向TOX的TF，包括NR5A2、ETV1和ARID5B，其在末端Tex细胞中表现出高调节子特异性(图2I)，并在>50%的癌症类型中显示出统计学显着性。

作者还识别了先前未知与T细胞耗竭相关的关键转录调节因子，包括SOX4和FOXP3(图2I)。特别是SOX4，具有高调节子特异性评分，并在所有癌症类型的三分之二中显示出统计学显着性。作者推断SOX4在Tex细胞中发挥了类似的功能，尽管这还需要进一步验证。FOXP3同样具有高调节子特异性评分，仅在47%的所有癌症类型中显示出统计学显着性。由于FOXP3对Treg细胞功能很重要，因此CD8+FOXP3+T细胞(CD8+Treg细胞)与耗竭之间的联系值得进一步研究。表达SOX4或FOXP3的细胞频率在癌症类型之间显着不同(P<0.01，Kruskal-Wallis检验)，反映了不同TME对Tex细胞表型的不同影响。

图2 CD8+耗竭T细胞的异质性和动力学

CD4+区室中潜在肿瘤反应性T细胞的特性

在CD4+区室中，主要的潜在肿瘤反应性元簇是IFNG+TFH/TH1和TNFRSF9+Treg细胞。全局扩散图和RNA速度分析表明，CD4+T细胞可以从幼稚T细胞分别发育为Temra细胞、TFH/TH1细胞或TNFRSF9+Treg细胞(图3A)。为了获得更精确的发展轨迹，作者分别对每个方向进行了轨迹推断。两个与TFH细胞相关的元簇显示出从经典IL21+TFH细胞到IFNG+TFH/TH1细胞的逐渐转变过程(图3A和B)。在这个转变过程中，I型反应相关的细胞因子和细胞毒性效应分子-包括IFNG、GZMB和PRF1-显着增加(FDR<0.01，广义加性模型)(图3B)。

对于Treg细胞，出现了从TNFRSF9-Treg细胞到TNFRSF9+Treg细胞的轨迹(图3A)，表明从静息状态(TNFRSF9-)逐渐过渡到激活状态(TNFRSF9+)。ISG+Treg细胞位于轨迹的中心，表明一部分Treg细胞在激活过程中对TME中的I型干扰素有反应，这与最近的一份报告一致，表明高ISG作为在CD4+T细胞激活中间状态的一个特征。这种Treg细胞发育轨迹在癌症类型中很常见(图3C)。

作者识别了多个以前未发现的TNFRSF9+Treg细胞标志基因，包括那些编码具有激酶活性的膜蛋白[CAMK1和IGF2R]、细胞因子受体[IL15RA]、已知药物靶点[IFNAR2和TOP1]，以及TFs[TGIF2和HIVEP1](图3D)。HIVEP1被推断为143个靶基因的关键调节因子，其中大部分也是TNFRSF9+Treg细胞的标志基因，包括TNFRSF4、TNFRSF9、ID3、IL21R和VDR(图3E和F))。HIVEP1在Treg细胞轨迹的后期加速表达，这与其他已知的Treg细胞TF(如FOXP3和BATF)在Treg细胞轨迹的早期阶段“开启”的模式不同。

图3 潜在肿瘤反应性CD4+T细胞的特性

TME塑造肿瘤浸润性T细胞图谱

作者检测了与肿瘤中不同T细胞组分相关的外在因素。虽然作者没有发现每个元簇的频率与年龄、性别或临床分期之间存在紧密关联，但作者发现IL21+TFH细胞的频率与体重指数(BMI)之间存在很强的关联。此外，某些元簇明显表现出组织特异性。癌症类型对T细胞群的频率产生广泛影响，因为作者观察到不同癌症类型的不同T细胞分布模式(图4A)。肿瘤突变负荷(TMB)与ICB的功效有关。通过将肿瘤分为TMB高组和TMB低组，作者发现只有CD4+TFH/TH1细胞的频率与TMB显示出强相关性(FDR26.3%)。作者还确定了FAT1突变与TNFRSF9+Treg细胞之间的正相关(图4B)。因此，肿瘤中的T细胞组分不仅受潜在新抗原数量的影响，还受癌细胞的特定体细胞突变的影响。

为了揭示不同癌症类型的T细胞组分的整体模式，作者检查了肿瘤中元簇之间的频率相关性，并识别了几个高度相关的元簇模块。一个模块由三个ISG+元簇组成，而四个CD8+Tex细胞群、TFH/TH1细胞和TNFRSF9+Treg细胞形成另一个模块。具有相似基因签名但来自不同区室(CD8+Tc、CD4+TH和CD4+Treg细胞)的元簇倾向于聚集在一起(例如，CD8+Tc17和CD4+TH17细胞)。潜在的肿瘤反应性元簇与某些元簇呈负相关，这可以用几种机制来解释，包括元簇之间的动态状态转换。正相关的元簇通常在标志基因之间有显着重叠(P<0.01，超几何检验)(图4C)，表明相同的调节子在不同的T细胞群中诱导了相似的转录程序。

图4 TME塑造肿瘤浸润性T细胞图谱

由T细胞组分定义泛癌免疫类型

接下来，使用这些相关元簇的频率，作者发现肿瘤样本可以分为八组(C1到C8)(图5A)。C1和C2具有高频率的终末Tex细胞，C1也具有最高频率的TNFRSF9+Treg细胞。C3至C8的肿瘤具有低频率的终末Tex细胞和高频率的CD8+ZNF683+CXCR6+Trm细胞，可进一步分为以幼稚T细胞(C7)、富集幼稚T细胞(C8)、富集Temra 细胞(C6)、富集Tc17或TH17细胞(C4)以及低频TNFRSF9+Treg细胞(C5)为主的不同组。尽管每种免疫类型都包括混合癌症类型，但某些癌症类型表现出明显的偏好。例如，近一半的食管癌和鼻咽癌肿瘤属于C1。相比之下，甲状腺癌和子宫内膜癌富集在C3。超过一半的黑色素瘤属于C2，其具有高Tex细胞但较低的TNFRSF9+Treg细胞频率，这与其对ICB的反应趋势一致。基底细胞癌和肝细胞癌都富集在C4。这些基于T细胞的免疫类型为了解肿瘤浸润性T细胞的整体特性提供了参考，这可能有助于指导新疗法的开发和患者分层，而不是传统的癌症类型指标。

这种免疫类型分类可能具有临床意义。使用免疫类型标志对TCGA癌症患者进行分层，作者发现TexloTrmhi(C3到C8)肿瘤在跨癌症类型中的总体生存率高于TexhiTrmlo肿瘤(C1和C2)(图5B)。由于T细胞是许多免疫疗法的直接靶标，因此基于T细胞的免疫类型在逻辑上可能与治疗效果相关。对已发表的黑色素瘤PD-1抗体治疗数据的重新分析表明，响应性肿瘤具有较低频率的终末Tex细胞和较高频率的初始T细胞(图5C)。在另一个数据集中复制了Tex细胞连接，表明响应者组比无响应者富含更多的TexloTrmhi肿瘤(Fisher精确检验，P=0.025)。响应者的治疗前肿瘤也有较高的Tc17频率(图5C)，暗示Tc17在ICB治疗中的重要作用。需要进一步的研究来揭示这一发现与Tc17在肿瘤中也可能耗竭的概念有何关联。

图5 由T细胞组分定义的泛癌免疫类型

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总结与讨论

作者系统地表征了来自各种人类癌症的T细胞，研究了从基因表达特征和异质性到状态转换和调节的不同方面。多个富含肿瘤的元簇，包括Tex、TFH/TH1和TNFRSF9+Treg细胞，值得特别关注，因为它们具有潜在的肿瘤反应性。作者的分析揭示了T细胞耗竭的多种途径以及这些途径的癌症类型偏好。这种图谱描绘加深了我们对癌症免疫的理解，并将促进治疗发展。

肿瘤中的T细胞状态和浸润受到多方面因素的影响，例如肿瘤内在和代谢因素。在作者的数据中，TMB与TFH/TH1细胞呈正相关，而BMI与TFH细胞呈正相关。因为之前TMB和BMI都与ICB反应有关，作者的研究结果强调了TFH相关细胞群在抗肿瘤反应中的重要性。此外，特异性突变可能会影响TME中的T细胞组分。FAT1突变与TNFRSF9+Treg细胞频率呈正相关。这种关联可能是由癌细胞中的FAT1-Hippo-YAP1通路功能障碍介导的。肿瘤突变对浸润免疫细胞的影响正在显现，这种联系机制在未来可能会得到积极探索。此外，作者的研究表明，不同癌症类型的不同TME中T细胞组分存在显着差异，并提出了一种利用肿瘤浸润T细胞整体特性的免疫分型方案。随着基于单细胞的免疫分型的进一步调整，可以重现复杂的肿瘤浸润性T细胞特性，我们将在开发个性化未来免疫疗法时更好地了解情况，以实现最大的临床效益。

参考资料

Zheng, L., Qin, S., Si, W., Wang, A., Xing, B., Gao, R., Ren, X., Wang, L., Wu, X., Zhang, J., Wu, N., Zhang, N., Zheng, H., Ouyang, H., Chen, K., Bu, Z., Hu, X., Ji, J., & Zhang, Z. (2021). Pan-cancer single-cell landscape of tumor-infiltrating T cells. Science (New York, N.Y.), 374(6574), abe6474.

https://doi.org/10.1126/science.abe6474

数据

http://cancer-pku.cn:3838/PanC_T

代码

https://zenodo.org/record/5461803#.YcKUpS8Rp9c