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作图丫

发布于 2022-03-29 09:45:14

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发布于 2022-03-29 09:45:14

文章被收录于专栏：作图丫

导语

GUIDE ╲

范可尼贫血(FA)通路是一种典型的、多酶调节的DNA损伤修复剂，它影响着包括癌症在内的疾病的发生和发展。关于FA相关基因(FARGs)的作用及其在癌症中的预后价值的综合分析报道很少

背景介绍

相信大家已经了解很多基因集结合癌症免疫和预后的研究了，我们常见的也是这两年比较热门的m6A、铁死亡等等相关的基因集，但是我们可以研究的远不止这些，今天小编给大家介绍的文章题目为：Fanconi Anemia Pathway GenesAdvance Cervical Cancer via ImmuneRegulation and Cell Adhesion.作者从FA 相关基因出发，首先进行泛癌分析，发现在HPV相关的癌症中起到作用，于是构建预后风险模型，最后进行了免疫相关和预后相关的分析。

数据介绍

GSCA:癌症数据及其临床特征信息

TCGA:宫颈癌鳞状细胞癌(CESC)和其他癌症的详细数据

GEO:GSE3791和GSE63514,对CESC OS和RFS的预后生存分析

结果解析

FA相关基因表达的改变及泛癌分析

流程图见图1A，使用GSCALite平台进行可视化显示，基因表现出不同的表达模式(图1B)。根据分子差异表达频率(图1C)，将基因分为三组：“极显著(esFARGs)”、“一般显著(gsFARGs)”和“不显著(nsFARGs))。对于esFARGs(图1F)，生存分析显示，大多数高表达水平与ACC、LGG、KIRC、KICH、KIRP、MESO和SKCM的生存预后差相关，与THYM、READ和CESC的生存预后好相关(图1D)。CNV分析显示，BRCA2（29%）和BRCA1（17%）是突变最频繁的两个基因，错义突变的发生程度最高(图1E)。此外，person相关性表明，在癌症中，大多数FARG的表达水平经常与CNV显著相关，特别是在LUSC、CESC、UCS、BRCA和OV中(图1G)。

利用GSCALite平台对FARG的甲基化水平和其他表观遗传信息进行了分析和可视化，如图1H所示。甲基化水平和基因表达之间表现出普遍的负相关(图1I)。GSVA分析指出esFARGs可以激活细胞周期和细胞凋亡，抑制RAS/MAPK信号通路和激素ER(图1J)。

图1

基于宫颈癌中FARG表达的预测评分及预后模型的建立

作者研究了HPV+和HPV患者之间表达模式的显著差异，鉴定了超过7000个差异表达基因(DEGs)；79个FARGs中有41个涉及(图2A，B)。GSVA结果表明，差异基因主要集中在各种“异常”过程，说明对维持正常的生理状态有不可或缺的作用(图2C)。接下来，进行LASSO Cox回归分析，选择8个os相关基因和5个RFS相关基因，建立一个名为FPS的风险评分(图2D、G)。

根据FPS中位数将患者分为高低FPS组时，CC OS(p<0.001)和RFS(p<0.001)生存图呈现不同的趋势，5年AUC接近0.8（图2E、F；图2H、I）。采用单因素和多因素Cox回归分析，评估上述因素是否为临床病理特征的独立预后因素。对于OS，单因素Cox回归分析的FPS为4.840(图2J)，而多因素Cox回归分析的FPS为8.728(图2L)。RFS相关分析的结果也表明，FPS确实是唯一稳健的CC预测因子(图2K，M)。

图2

预后风险评分的亚组识别和宫颈癌相关免疫预后风险评分的发展

与低FPS组相比，RFS组共有404个上调基因和236个下调基因，RFS组分别有745个上调基因和583个下调基因(图3A)。功能富集分析结果表明，显著富集在免疫相关的生物过程（图3B、C）。当将这些DEGs与从Immport数据库中获得的免疫相关基因进行比较时，发现有258个RS和RFS模式的基因(图3D)。

采用Cibersort方法评估CC患者免疫浸润丰度的差异(图3E)。CC病例的比较显示，CD8 T细胞、静止CD4记忆T细胞、调节性T细胞、静止树突状细胞、静止树突状细胞和活化肥大细胞有显著差异(图3F)。Kaplan-Meier生存分析显示，Tregs浸润与更好的OS结果(图3G)关联。

为了进一步探讨FARGs与免疫过程之间的潜在关联，作者选择了与FARGs和CC预后相关的关键免疫相关基因进行评估(图3D)。基于单因素Cox分析，共鉴定出50个免疫相关基因进行OS模型拟合。接下来，lasso Cox回归分析确定了核心免疫元素作为免疫特征，用于计算风险评分。根据免疫特征，通过系数和基因表达量计算IPS，然后根据IPS中位数将CC样本分为两个不同的风险组。两组患者的OS有不同的变化趋势，2年和5年的AUC均大于0.8(图3H、I)，图3J显示IPS与T细胞、B细胞、M2巨噬细胞、NK细胞的丰度呈显著负相关。

这些数据表明，FARGs与免疫基因相关，IPS可作为OS和RFS CC预后预测的可靠信号。

图3

宫颈癌FA相关基因一致性聚类

为了确定FARG的潜在功能，进行了一致性聚类分析，以区分FARG的表达模式，并将CC患者分为三个亚组。通过主成分分析（图4A）和t-SNE（图4B）分析进行聚类测试，患者分组良好。

基于亚组的 Kaplan-Meier 生存分析表明，cluster1 具有最短的 OS 趋势（图4C）。为了进一步评估三个cluster的功能，在cluster之间筛选了DEG，总共确定了 90 个共享的 DEG（图4D）。随后，基于这些共有的DEG进行功能富集分析，并富集到细胞粘附相关的生物过程和信号通路（图4E）。cluster之间存在显着差异：cluster1 的 Facscore 最高，cluster2 的得分最低（图4F）。根据Facscore的中位数，将CC患者分为Facscore高低两组，然后进行Kaplan-Meier生存分析。结果表明，Facscore 高的患者与 OS（图4G）和 RFS的不良预后相关。

为了区分更强大的预后预测因子，构建了lasso Cox回归模型，确定了17个OS预测的关键因素和6个RFS预测的关键因素(图4H)。在随后的分析中，发现基于上述变量计算的粘附相关预后风险评分(APS)也可以被认为是CC OS预测的基本特征(p<0.001)，2-和5年AUC大于0.8(图4I，J)。这些结果表明，细胞粘附相关调控因子在CC中具有重要的预后价值。为了进一步探索FARGs与APS之间的相关性，作者开发了一个基于mRNA表达的网络(图4K)。

图4

建立基于FA相关基因调控因子、免疫特征和细胞粘附指标的宫颈癌综合预后模型

根据lasso Cox分析，通过35个候选基因中的21个计算出综合预测评分(CPS)，可以将样本分为高、低风险，2年、3年、5年的AUC均大于0.8(图5A-C)。为了评估CC患者的生存概率，作者建立了一个基于年龄、吸烟状态、流产、妊娠、HPV状态、分级和分期等预后预测因素的列线图预后预测模型(图5D)。校准曲线显示了精度（图5E）。当比较FPS、IPS、APS和CPS时，可以明显看出CPSC指数(图5F)、决策曲线效益(图5G)、2、3、5年生存预测的AUC显著高于其他指标。结果表明，单因素Cox回归分析的CPS为2.753(图5G)，而多因素Cox回归分析的CPS为2.370(图5H)。PTO是CC中OS的另一个重要因素。

图5

基于机器学习模型的预测宫颈癌预后的基因特征

为了验证预测模型，基于FARGs开发了机器学习模型。随机选取70%的样本作为训练集，其余样本为验证集，在模型训练过程中采用5倍交叉验证方法。

OS预测决策树(DT)结果显示，ZBTB32、SLX1A、CENPS、TOP3A和EME1是所有因素中排名前5位的变量(图6A)。ZBTB32、CENPX、CENPS、FAAP100、TELO2采用随机森林选择(图6B)进行选择。采用朴素bayes(NB)模型识别ZBTB32、CENPS、RAD50、RPA2和RFC4(图6C)，采用OS预测的支持向量机模型(SVM)识别ZBTB32、CENPS、RAD50、PMS2和HUS1。ROC曲线显示，RF模型的精度最高(Figure6D)。对于RFS预测结果，RF模型的精度最高，为0.918，其次是SVM模型，为0.914(图6E)。

这些算法之间的overlap以及 LASSO Cox 回归模型、ZBTB32 和 CENPS 是指示重要预测值的相同元素（图6F）。PALB2 是 CC 中唯一与 RFS 相关的共享 FARG（图6G）。当生存分析使用两个选定的signature，发现CC患者高表达ZBTB32和CENPS有更明显的倾向于更长的OS时间(图6H)。RFS结果显示，PALB2和BRCA2高表达的患者更有可能有不良的结果，但两者都低表达的组并没有最好的结果(图6I)。

图6

宫颈癌关键特征的进一步分析

作者在RNA水平上检测了4个关键FARGs的表达，并在蛋白水平上评估了其相互作用。GSE6791的Boxplot显示，CC患者中PALB2、CENPS、BRCA2表达上调，而ZBTB32表达下调(图7A)。随后，对这四种调控因子进行蛋白相互作用(PPI)网络，观察到存在大量的FARGs和与每个节点的连接，但除BRCA2和PALB2外，四种调控因子之间没有直接连接(图7B)。作者研究了除FA相关网络外的其他大型免疫相关网络(图7C)。

ZBTB32可能主要通过影响免疫相关调节过程，而不是仅仅通过影响FA通路来保护CC患者免受不良结局。此外，ZBTB32在CC期间的表达有显著差异(图7D)，提示早期临床筛选作为生物标志物的价值。不幸的是，其他三个都不合适。qPCR结果强调了CC中4个signature的差异(图7E)。

最后，进行了药物敏感性分析，如图 7F 所示，CENPS的高表达与对白屈菜红碱、异环磷酰胺和PX-316相关，而 ZBTB32 的高表达与 hydrastinine HCl 和高三尖杉酯碱抗性有关。