老生常谈的缺氧+肿瘤怎么样做出新花样？

作图丫

发布于 2022-03-29 09:46:21

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导语

GUIDE ╲

肿瘤内缺氧和免疫与肿瘤患者的预后高度相关。然而，还没有对膀胱癌（BLCA）中缺氧反应与免疫之间关系的系统分析。

背景介绍

继上次小编为大家介绍的缺氧+免疫双基因集共同确定肿瘤预后Signature（基因集肿瘤分型还能这么做？），今天小编再介绍一篇缺氧+免疫玩出新花样的纯生信文章，发表在Cell旗下的Molecular Therapy-Oncolytics，影响因子7.2分。

数据介绍

为了扩大样本量，作者将四个膀胱癌的GEO数据集（GEO：GSE13507、GSE32548、GSE32894和GSE48075）和TCGA数据集（TCGA-BLCA）的995个样本合并为膀胱癌的新队列。

结果解析

膀胱癌缺氧的标签

缺氧研究设计如图1A所示。

作者使用ConsensusClusterPlus包来选择最佳的聚类数，发现在膀胱癌队列中存在五种不同的缺氧反应模式，其中A型165例，B型197例，C型235例，D型143例，E型255例，分别命名为HPX-cluster A到HPX-cluster E(图1B)。无监督分层聚类显示，clusterA-clusterE之间缺氧反应相关基因差异表达(图1C)。Kaplan-Meier生存曲线也显示，患者的预后在5个cluster之间存在显著差异(P = 0.0133)，clusterD与其他模式相比具有特别显著的生存优势。

图1

缺氧与免疫微环境

为了找到免疫微环境和缺氧反应模式之间的关联，作者通过ssGSEA计算了TME免疫细胞的相对数量。聚类热图分析显示，不同的cluster表现出不同的TME免疫细胞浸润(图2A)。Pearson相关性分析显示，Treg细胞与几乎所有免疫细胞均显著正相关，说明膀胱癌的免疫微环境内存在一个反馈回路调节系统。当效应TME免疫细胞显著浸润时，Treg细胞会通过增加效应TME免疫细胞的数量来应对这种现象。

图2

不同缺氧模式下的生物学通路

通过对KEGG通路进行ssGSEA分析，研究了五种不同模式的生物过程。clusterA在转化生长因子(TGF)-β信号通路、WNT信号通路、NOTCH信号通路等间质和致癌通路中显著激活;clusterB与clusterA表现出相似的趋势，但在致癌基因集的通路中富集程度较低。clusterC表达了与癌症相关的通路富集，包括mTOR和TP53信号通路，而clusterD则注释了与免疫激活相关的通路;clusterE与DNA损伤修复相关通路显著相关，但与免疫激活生物学过程显著负相关。

值得注意的是，clusterA被免疫细胞高度浸润，但这种表型的患者并没有表现出匹配的生存优势。clusterD在CD8 T效应细胞、抗原加工机制和免疫检查点签名中显著富集，但在TGF-β/EMT信号通路中失活(图2C)。

因此，五种缺氧反应模式具有非常不同的TME免疫细胞浸润表型特征，其中clusterA/B具有高度免疫细胞浸润和基质活化的特征，更有可能是免疫排斥表型;clusterD的特征是充分的免疫激活和效应免疫细胞浸润，是一种免疫炎症表型，而clusterC/E是一种免疫抑制表型。

TCGA队列的缺氧模式

因为TCGA包含临床病理参数，因此接下只在TCGA队列调查缺氧模式的生存。与meta队列相似，无监督共识聚类也在TCGA膀胱癌队列中识别出5个不同的cluster。clusterC/E组预后较好，而clusterA/B组预后较差(P = 0.015;图3A)。

作者想进一步了解clusterC/E的生存优势是否与临床病理特征，如肿瘤-淋巴结转移(TNM)分期和治疗结果相关。然而，TNM分期和初级治疗结果没有显著差异。作者推断可能是由于TME免疫细胞浸润的差异所致。TCGA队列中的clustererE表现出与meta队列中的clusterD相似的TME免疫细胞分布，其特征是高效TME免疫细胞浸润，但TCGA-BLCA队列的clusterC的浸润性明显低于clusterE(图3B)。

图3

为了进一步探索每个cluster潜在的生物学过程，作者确定了每个cluster的差异表达基因。利用clusterProfiler软件包对每个聚类的差异表达基因进行GO富集。clusterA在角化细胞分化和角化过程中富集，是间质信号通路的激活；clusterC在与上皮发育相关的通路中显著富集，可能是良好预后的原因；clusterE在与免疫激活相关的通路中显著富集(图3E)。综上，缺氧在TME内的免疫调节中发挥着不可或缺的作用。

正不同缺氧模式下的肿瘤体细胞突变

使用maftools包和complexheatmap包研究了不同cluster间体细胞突变的分布差异。利用30个高度变异突变基因的瀑布图显示突变景观。如图4A所示，在clusterE中，前30个突变基因的突变率最高，尤其是TP53和RB1，被认为是ICIs在肿瘤患者中的敏感性的原因(图4A)。此外，clustererE与较高的肿瘤突变负担(TMB)显著相关，而clusterB与最低的TMB相关(图4B)。

基因集功能注释显示，错配修复信号通路的标签的富集在clusterE中显著增强(图4C)。综上，缺氧反应模式不仅区分了TME免疫细胞浸润，而且还与突变相关。

图4

构建缺氧打分模型

作者构建了一套评分系统来量化膀胱癌个体的缺氧反应模式，即HPXscore。作者通过合并每个cluster中的差异表达基因确定了2257个meta-DEGs。基于单变量Cox回归分析，在2257个与预后相关的meta-DEGs中，394个最终被定义为缺氧表型相关的预后候选基因。然后，对这些基因进行LASSO-Cox回归分析，以获得更能代表低氧反应模式的低氧表型相关基因标签。最后选取12个基因建立HPXscore。

作者将患者分为高或低HPXscore组，以确定HPXscore在预测患者预后方面的价值。Kaplan-Meier生存曲线显示，HPXscore低的患者具有显著的生存收益（P < 0.00001;图5A)，其5年生存率是HPXscore高的患者的两倍(53.2%vs27.1%)。上述结果在meta-BLCA队列中也得到验证(P = 0.0032)。

作者进一步探究了缺氧表型相关基因Signature的特征。HPXscore低的患者富集在免疫激活特征方面，而HPXscore高的患者与基质通路的增强富集显著相关(图5C)。综上，低HPXscore与免疫激活显著相关，而高HPXscore与基质激活高度相关。

图5

作者接下来确定了HPXscore与临床特征和分子亚型之间的相关性。高HPXscore患者预后更差，更容易发展成TNM阶段、被lympho-vascular入侵和淋巴阳性。低HPXscore组则观察到相反的结果(图3B)。

TCGA和其他独立研究小组对膀胱癌进行了全面的分子景观构建，并将膀胱癌划分为多个不同的分子亚型。作者评估了这些分子亚型之间HPXscore的差异，发现HPXscore低的患者在腔内，腔，TCGA I / II 期，尿路上皮样A（UroA ）和基因组不稳定(GU)分子亚型中积累，这些与低恶性肿瘤和更好的生存相关。然而，以恶性程度高、预后较差为特征的基底层、基底层鳞状上皮、tp53样、TCGA III/IV、基底层/ scc样分子亚型明显集中在高HPXscore组(图5E、5F)。

此外，作者发现与高HPXscore组相比，HPXscore低的患者与TMB高相关，表明HPXscore与TMB呈显著负相关(Wilcoxon检验，P = 1.3e−5，图5H)。接下来，根据HPXscore和TMB水平将所有患者分为四组。Kaplan-Meier生存曲线显示，无论TMB高低，HPXscore较低的患者均具有显著的生存优势(log-rank检验，P < 0.00001，图5I)。

缺氧评分可作为独立预后因素

HPXscore、TMB、病理T期、病理N期和年龄是可以用来预测膀胱癌患者预后的独立因素(图6A和6B)。通过结合独立的预后因素，构建了一个列线图，预测膀胱癌患者的死亡率(图6C)。每个病人将被分配一个总点数，通过为每个预后参数添加点数。总分越高，患者预后越差。此外，校准图表明，列线图具有与理想模型相似的性能(图6D和6E)。决策曲线分析(DCA)也显示nomogram有很高的临床应用潜力(图6F和6G)。

图6

缺氧评分预测免疫治疗临床反应

基于ICIs的免疫疗法已成为癌症治疗的重大突破。作者利用IMvigor210 (mUC)队列研究HPXscore是否可以预测BLCA的免疫治疗益处，该队列包括接受PD-L1抑制剂atezolizumab的转移性尿路上皮癌(mUC)患者。Kaplan-Meier生存曲线显示，与HPXscore高组相比，HPXscore低的患者具有显著的临床获益和显著延长的生存时间(log-rank检验，P < 0.001，图7A)。

富集分析显示，在HPXscore低的患者中，CD8 T效应因子、抗原加工机制和免疫检查点等免疫激活信号显著富集，而在HPXscore高的患者中，EMT/TGF-β和WNT/靶通路等基质信号高度激活(图7B)。然后，相关矩阵显示HPXscore与基质相关Signature呈正相关，与免疫激活相关Signature和错配修复Signature呈负相关(图7C)。