跟上热点！5+细胞焦亡分析思路来咯！

导语

GUIDE ╲

细胞焦亡（Pyroptosis）又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡是由gasdermin介导的细胞程序性坏死。

背景介绍

今天，小编给大家带来了细胞焦亡相关基因（PGs）在卵巢癌患者的预后以及与免疫浸润中作用的相关思路，这篇文章于2021年发表在《Cell Death Discovery 》期刊上，最新影响因子5.241，题目为:A novel defifined pyroptosis-related gene signaturefor predicting the prognosis of ovarian cancer.

数据介绍

TCGA：379个OC患者的RNA-seq数据及临床数据

GTEx：88个正常卵巢样本的RNA-seq数据

GEO：GSE140082的RNA-seq数据和临床信息（随访时长4年），作为外部验证队列

结果解析

01

正常组织与肿瘤组织间DEGs的鉴定

作者比较了88个正常和379个肿瘤组织的33个自噬相关基因的表达水平，确定了31个差异表达基因(DEGs)(P<0.01)。热图展示了这些基因的RNA水平（Fig.1A）。

为了进一步探讨这些自噬相关基因的相互作用，进行了蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析，结果如Fig.1B所示，确定CASP1、PYCARD、NLRC4、NLRP1、CASP5、NLRP3、CASP8和AIM2是hub基因。其中，除了CASP1之外，其他基因都是正常组织和肿瘤组织之间的DEGs。包含所有自噬相关基因的网络如Fig.1C所示。

Fig.1

02

基于DEGs的肿瘤分型

为了探讨31个自噬相关的DEGs的表达和OC亚型之间的联系，作者对TCGA队列中的379名OC患者进行了一致性聚类。通过将聚类变量(k)从2增加到10，我们发现当k=2时，群内相关性最高，群间相关性较低，这表明379名OC患者根据31个DEGs可以很好地分为两个cluster(Fig.2A)。热图展示了基因表达特征和临床特征，包括肿瘤分化程度（G1-G3）、年龄（≤60或>60岁）和生存状态（生存或死亡），但两个cluster之间的临床特征几乎没有差异（Fig.2B)。还比较了两个cluster的OS，但没有发现明显的差异(P=0.841，Fig.2C)。

Fig.2

03

TCGA队列中的预后基因模型的发展

作者通过单因素cox回归分析进行生存相关基因的初步筛选。保留符合P<0.2标准的7个基因(AIM2、PLCG1、ELANE、PJVK、CASP3、CASP6和GSDMA)进行进一步分析(Fig.3A)。通过LASSO回归分析，根据最优的λ值构建了一个7个基因的风险打分模型(Fig.3B、C)。公式为：risk score=(−0.187*AIM2 exp.)+(0.068*PLCG1exp.)+ (0.097*ELANE exp.)+(−0.143*PJVK exp.)+−0.086*CASP3 exp.)+ (−0.033*CASP6 exp.)+(0.130*GSDMA exp.).

根据风险评分的中值评分，374名患者被平均分为低风险和高风险亚组(Fig.3D)。主成分分析(PCA)显示，不同风险的患者被分为两个cluster（Fig.3E)。高风险组的患者比低风险组的患者死亡人数更多，生存时间较短（Fig.3F）。在低高风险组之间检测到OS的显著差异(P<0.001，Fig.3G)。ROC分析来评估预后模型的敏感性和特异性，发现ROC曲线下面积1年为0.628,2年为0.662,3年为0.607(Fig.3H)。

Fig.3

04

对风险特征的外部验证

利用GSE140082队列的380名OC患者作为验证集。在进一步分析之前，基因表达数据通过“Scale”功能进行标准化。根据TCGA队列的风险评分中值，GEO队列中的203名患者划分为低风险组，其他177名患者为高风险组(Fig.4A)。主成分分析显示两个亚群之间分离的比较显著（Fig.4B)。低风险亚群中的患者比高危亚群的生存时间更长，死亡率更低（Fig.4C)。K-M分析也表明，低风险组和高风险组之间的生存率有显著差异(P=0.014，Fig.4D)。对GEO队列的ROC曲线分析表明，构建的模型具有良好的预测效果(1年AUC=0.766,2年为0.655,3年为0.584)(Fig.4E)。

Fig.4

05

风险模型的独立预后价值

使用单因素和多因素Cox回归分析来评估基于基因特征模型的风险评分是否可以作为独立的预后因素。单因素Cox回归分析表明，风险评分是预测TCGA 和 GEO 队列中生存率低的独立因素（HR = 3.285，95% CI：1.973-5.467 和 HR：2.613,95% CI：1.319-5.175，Fig.5A、C)。多因素cox分析还表明，在调整其他混杂因素后，风险评分对于两个队列中的 OC 患者是一个预后因素（Fig.5B， D) 。此外，为 TCGA 队列生成了临床特征的热图（Fig.5E），发现患者的年龄和生存状态在低风险和高风险亚群之间呈不同分布（P < 0.05）。

Fig.5

06

基于风险模型的功能分析

为了进一步探讨由风险模型分类的亚群之间基因功能和途径的差异，我们利用limma包通过应用FDR<0.05和|log2FC|≥1标准来提取DEGs。在TCGA队列中共确定了115个DEG。其中，高风险组有66个基因上调，其余49个基因下调。然后基于这些DEGs进行了GO富集分析和KEGG通路分析。结果表明，DEGs主要与免疫反应、趋化因子介导的信号通路和炎症细胞趋化性相关（Fig.6A，B)。

Fig.6

07

亚组间免疫活性的比较

在功能分析的基础上，利用单样本基因集富集分析(ssGSEA)，进一步比较了TCGA和GEO队列中16种免疫细胞的富集分数和高风险群体之间13种免疫相关途径的活性。在TCGA队列中(Fig.7A)，与低风险亚群相比，高风险亚群通常具有较低水平的免疫细胞浸润水平，特别是CD8+T细胞、中性粒细胞、NK细胞、Th细胞（Tfh、Th1和Th2细胞）、肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和调节性T(Treg)细胞。除了type-2 IFN反应途径外，其他12个免疫途径在高风险组中的活性低于TCGA组中的低风险组(Fig.7B)。此外，发现树突状细胞(DCs)、诱导树突状细胞(iDCs)和巨噬细胞在低风险组中被富集，而与高风险组相比，type-2 IFN反应被下调(Fig.7C、D)。

Fig.7

小编总结

总之，作者的研究表明细胞自噬与OC密切相关，因为正常组织和OC组织之间的大多数自噬相关基因表达不同。作者基于7个自噬相关基因的风险特征产生的评分是预测TCGA和GEO队列中OS的一个独立危险因素。低风险组和高风险组之间的DEGs与肿瘤免疫相关。作者的研究为预测OC患者的预后提供了一种新的基因特征，并为未来研究自噬相关基因与OC免疫之间的关系提供了重要基础。