【单细胞文献解读】肿瘤细胞的多样性驱动肝癌微环境重组

导语

GUIDE ╲

肿瘤细胞的生物学多样性是实体恶性肿瘤治疗失败和导致患者较差预后的关键因素。

今天小编给大家分享的是一篇由美国国家癌症研究所的团队在 CancerCell 杂志发表了题为：Tumor Cell Biodiversity Drives Microenvironmental Reprogramming in Liver Cancer的论文。这项工作通过对19例肝癌患者的单细胞数据进行分析，发现在肿瘤间恶性细胞存在多样性，且肿瘤微环境同样存在较大差异，并在765个肝癌患者的独立数据集发现了一致性的结果。

背景介绍

在癌症的发生发展过程中，各组织类型之间往往存在复杂的基因组学和肿瘤微环境。这些多样性特征使得分子靶向治疗的开展极其困难。同时，如何在成千上万个passenger基因中有效识别driver基因十分困难，这同样限制了精准肿瘤治疗策略的可预测性。

因此，癌症基因组的多样性，特别是瘤内异质性（ITH），会导致肿瘤治疗的失败。而单细胞水平上的肿瘤细胞分子特征可能有助于识别阐明癌症的驱动因素以及癌症发展的时间顺序。

主要结论

一、HCC（肝细胞癌）和iCCA（肝内胆管癌）具有不同程度的转录多样性；

二、肿瘤转录多样性与患者预后相关；

三、肿瘤来源的血管内皮生长因子驱动微环境重组；

四、较高异质性来源的肿瘤T细胞具有较低的细胞溶解活性。

结果解析

01

原发性肝癌单细胞转录组数据分析

为了检验肿瘤细胞的多样性，该团队对使用免疫检查点抑制剂临床试验的患者的新分离的HCC和iCCA患者中进行了单细胞RNA测序(scRNAseq)测序。其中训练集共有12名患者(set 1)，验证集共有7名患者(set 2)。

本工作首先对数据进行标准化，在每个细胞中检测到超过500个基因的细胞得以保留，获得了set 1中5115个细胞的单细胞转录组，然后对所有细胞中差异最大的2244个基因进行主成分分析。

t-SNE分析分析表明，患者的细胞有的形成了不同的集群，而另一些则相互重叠。并发现一些细胞表达高水平的上皮标记基因，提示具有潜在的原癌性(图1C)。

通过推断基于转录组的大规模染色体拷贝数变异(CNVs)，进一步区分了702个恶性细胞和4380个非恶性细胞(图1D)，并基于上皮标记基因和肝脏标记基因成功富集出恶性和非恶性细胞，这些标记基因的表达与恶性细胞和非恶性细胞的核型高度一致(图1E)。

02

肝癌的异质性

通过对恶性和非恶性细胞进行t-SNE分析发现，恶性细胞形成了患者特异性细胞簇，同时也观察到肿瘤内部细胞同样存在异质性，表明肿瘤间和肿瘤内均存在转录组异质性(图2A)。

相比之下，非恶性细胞主要根据细胞类型进行分组(图2B)。文章比较了肿瘤患者中恶性细胞和非恶性细胞比例的变化(图2C)，并选择其中具有超过20个恶性细胞的8个样本进行分析。这8例患者中，基质细胞的组成同样具有高度异质性，突出了活检样本中复杂的TME(图2D)。其中，H23、H30、H37、H38为HCC, C25、C26、C29、C39为iCCA(图2E)。

03

肿瘤内异质性（ITH）与预后相关

文章通过对10个肝癌干细胞相关基因EPCAM、KRT19、PROM1、ALDH1A1、CD24、ANPEP、CD44、ICAM1、CD47和SOX9的平均表达水平的比较，确定了肿瘤细胞的邻近相似性与细胞干细胞的关系(图3A)。并且通过对所有恶性细胞的相关性分析，进一步揭示瘤内转录组的多样性(图3B)。

为了进一步确定ITH的水平，文章开发了一种计算肿瘤细胞特异性转录组多样性得分的方法。使用PCs代替原始的恶性细胞基因表达谱来测量每个肿瘤的多样性(即ITH)，以捕获主要信息并减少噪声(图3C)。

根据特征值排列检验选择前30个个体(图3D)。然后根据肿瘤样本的多样性得分将8个肿瘤样本分为多样性高(div -high)组和多样性低(div -low)组(图3E)。多样性高组患者的总生存期和无进展生存期均明显低于多样性低组(图3F)。

对验证集（set2）应用多样性得分计算方法，分析显示，部分iCCA患者的多样性评分明显高于HCC患者(图3H)。

04

VEGF在恶性细胞中的表达与TME重组相关

在验证集set 1中，来自div - high和div - low肿瘤的非恶性细胞转录组不同(图4A)。当分析单个细胞类型时，差异进一步明显(图4B)，暗示TME可能与肿瘤细胞多样性有关。

文章发现，VEGFA主要表达于恶性细胞而非非恶性细胞中(图4D)。此外，VEGFA在div - high的肿瘤细胞内表达水平显著高于在div - low肿瘤细胞中(图4E)；并使用免疫组化分析验证了肿瘤细胞中VEGFA的表达模式(图4F)。

由于VEGFA是缺氧诱导因子1- α (HIF1A)的直接靶标，HIF1A是感应缺氧的关键因子，因此该团队确定set 1中， div - high的肿瘤比div - low的肿瘤更容易缺氧。该团队发现div - high组肿瘤细胞中缺氧相关基因的表达水平远高于div - low组(图4G)。

文章根据每种非恶性细胞类型的基因进行PCA分析。发现VEGFA功能性代理基因可以区分div - high和div - low 的TECs、TAMs和CAFs，但不能区分T细胞(图4I)。

05

div-low肿瘤T细胞具有溶细胞活性

文章使用基于共享最近邻(SNN)模块化优化的聚类算法确定了6种T细胞亚型(图5A)。结果显示，CD8+和CD4+ T细胞的分支来自轨迹树，其中，div - high T细胞倾向于聚集在树干上，而div - low T细胞则聚集在树枝上(图5B)。

文章基于信号通路基因进行了基因集富集分析。CD8+和CD4+ T细胞之间富集的通路基本一致(图6A)。此外，T细胞富集于干扰素-a (IFN-a)/IFN-g反应和MYC活性通路，以及细胞增殖(G2/M检查点和E2F靶点)通路，提示div - low肿瘤的T细胞可能具有溶细胞活性。

与div - high肿瘤相比，来自div - low肿瘤CD8+和CD4+ T细胞的细胞毒性相关基因(如GZMA、GZMB、GZMH和PRF1)均高表达(图6B和6C)。

小编总结

肝癌是世界上第二大致死恶性肿瘤，主要包括肝细胞癌(HCC)和肝内胆管癌(iCCA)。然而，大多数HCC和iCCA患者对分子靶向治疗的反应有限。本篇文章开发了一种测量肿瘤细胞多样性的方法，并证明肿瘤转录组多样性与接受免疫检查点抑制剂治疗的HCC和iCCA患者的总生存期相关。

本工作还发现包括T细胞功能障碍在内的TME极化与肿瘤来源的VEGF表达增加有关。这些结果表明转录组多样性评分在预测免疫治疗反应方面的实用性，并为免疫检查点阻断和抗血管治疗联合治疗提高疗效提供了理论基础。