6分+细胞焦亡思路来袭！

导语

GUIDE ╲

胃癌患者体内的幽门螺旋杆菌以及化疗药物可能会诱导细胞焦亡发生。然而，仍然缺乏使用细胞焦亡基因对胃癌进行预后评估的相关研究。

背景介绍

凋亡、铁死亡、自噬、焦亡等基因集的泛癌分析套路在近年来异常火热，那么今天小编继续给大家带来一篇新颖的细胞焦亡系列生信文章。这篇文章发表在Frontiers in Cell and Developmental Biology，最新影响因子6.68，文章题目为《The Pyroptosis-Related Signature Predicts Prognosis and Indicates Immune Microenvironment Infiltration in Gastric Cancer》。

数据介绍

作者不但获取了常规的来自TCGA和GEO的基因表达数据，还从医院获取了22个人体临床样本的胃癌和正常组织的RNA-seq数据。

结果解析

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胃癌中细胞焦亡相关调控因子的遗传改变和差异表达

作者首先定义了CASP1，CASP3，CASP4，CASP5，CASP8，GSDMB，GSMDC，GSDMD，GSDME，GZMA和GZMBGC这11个基因为焦亡调控因子。不同文章对焦亡相关基因的定义差距很大，先前的研究定义了33个基因（跟上热点！5+细胞焦亡分析思路来咯！）。

其次，作者使用STRING数据库（图1A）分析了这11个焦亡基因的生物功能网络，发现它们主要与免疫反应和细胞焦亡有关。在433个TCGA胃癌样本中有59个（13.63%）显示出与细胞焦亡相关的突变。其中，CASP5的突变频率最高（图1B）。另外，在GEO数据（GSE62717）中，有7个焦亡基因发现了CNV（图1C）。

为了观察细胞焦亡基因是否存在差异表达，作者首先使用k 均值对胃癌样本和正常样本进行聚类（图1E）。除GSDME和GZMA外，其余基因均在胃癌中高表达（图1F）。作者进一步在22对临床采集的肿瘤组织和正常组织样本中验证了细胞焦亡相关基因的mRNA水平，并复制了在TCGA数据中的结论（图1G）。因此，焦亡相关调控基因的表达水平几乎都与胃癌相关。

Figure 1

02

基于11个焦亡调控基因的亚型分类

作者使用四个GEO数据集，OS数据和临床信息创建了一个队列。基于11个焦亡相关基因的表达水平，使用无监督聚类将胃癌患者分为cluster1（n=267）和cluster2（n=351）（图2A)。cluster1的生存优势显著高于cluster2（图 2B）。随后，作者对这两个类别进行了GSVA富集分析（图2C）。cluster1富集在与免疫激活和凋亡途径相关通路，cluster2显示出致癌激活通路的富集（图2C）。

Figure 2

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两种亚型的免疫浸润情况

作者在CIBERSORT（https://cibersort.stanford.edu/index.php）网页工具上分析了两种亚型的免疫浸润情况，发现在cluster1中激活的先天免疫细胞浸润很丰富（图3A-B）。可能是因为这些树突状细胞、M1巨噬细胞、B细胞以及激活的CD4和CD8 T细胞的存在，赋予了cluster1患者显著的存活优势。cluster2则富含内皮细胞、肥大细胞、M2巨噬细胞和静息T4记忆细胞（图3A-B）。作者将cluster1归类为免疫炎症表型，将cluster2归类为免疫排除表型。另外，虽然这两种亚型不会增加或减少免疫浸润细胞的类型，但很可能会改变免疫细胞的比例，从而改变肿瘤微环境。

为了进一步探究这两个不同cluster的临床表现，作者使用了ACRG队列的 618名患者的临床信息（图3C）。大多数焦亡调控基因在cluster1中高表达。EMT分子亚型患者归入cluster2中，MSI亚型患者归入cluster1中。ACRG队列的患者生存情况也复制了上文的结果。早期胃癌患者与cluster1的焦亡调控模式相关，而晚期胃癌患者主要与cluster2焦亡调控模式相关，解释了上文cluster1 拥有更好的生存优势的原因。此外，作者又对ACRG队列中癌症复发的282名患者进行了统计分析，发现cluster2更容易复发（图3D）。因此，不同的细胞焦亡相关基因的调控模式拥有不同的胃癌特征，并具有不同的TME状态。

Figure 3

04

胃癌中两种细胞焦亡调控模式的基因标签

为了更好地将这些亚型应用于胃癌的临床治疗并确定每位患者的评分，作者探索了两种细胞焦亡调控模式之间的差异并确定了特定的基因特征。首先， 在四个GEO队列（GSE15459、GSE34942、GSE57303 和 GSE62254）中确定了113个差异表达基因（图4A）。使用单变量和多变量Cox回归分析确定了22个可用作独立预后特征的基因（图4B）。

从对独立预后基因的无监督聚类的热图中，作者发现cluster1与免疫反应的10个基因相关，cluster2与编码癌症发生蛋白的 12个基因相关（图4C）。为了构建能够量化每位患者的模型，作者使用 LASSO-Cox回归模型以最小λ保留22个差异基因中的6个，并使用这6个基因构建与焦亡相关的特征评分（图4D，表1）。

Figure 4

Table 1

05

细胞焦亡预后模型的构建

作者使用上述打分标准将患者分为高分组和低分数组，低分组比高分组具有明显的生存优势。在其他队列中可以复制该细胞焦亡模型的结果（图4E-F）。由ROC曲线得知，细胞焦亡模型预测胃癌患者3年生存率和5年生存率效果较好（图4G）。

作者将细胞焦亡模型与其他几种预后模型比较，发现细胞焦亡模型预测 胃癌患者预后优于其他模型（图4H）。该细胞焦亡预后模型的亮点在于，它的预后效果在七种消化道癌症中同样表现优异（CHOL、COAD、ESCA、LIHC、PAAD、READ 和 STAD）（图5A）。

作者进一步评估不同临床表现的患者的预后情况。随着患者生存期的增加，评分呈现逐渐升高的趋势，说明胃癌晚期患者的评分高于早期胃癌患者(图5E)。同样，治疗反应较差的EMT亚型得分也较高(图5F)。因为幽门螺杆菌是胃癌的主要病因，所以作者分析了幽门螺旋杆菌感染与该评分模型的关系。作者发现幽门螺旋杆菌感染患者得分可能更高。所有的证据都表明，细胞焦亡模型中分数越高，预后越差。

作者还发现不同的焦亡相关调控基因也会影响预后模型的特异性。除GSDME外，其他基因在高分组中的表达水平均显著降低(图5H)。GSDME在高分组中普遍表达水平较高可能与治疗期间患者的细胞因子释放综合征(CRS)有关。另外，低评分组的炎症信号通路明显富集，高评分组主要富集在与肿瘤发展相关的信号通路中(图5I)。

Figure 5

06

细胞焦亡相关调控因子与肿瘤微环境

作者在队列中分析了细胞焦亡基因与TME细胞的浸润情况（图6E-G）。免疫激活相关细胞，如激活的T细胞、NK细胞、M1巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞，与焦亡模型呈负相关。较高的分数与静息记忆细胞、单核细胞、肥大细胞、癌症相关成纤维细胞和内皮细胞密切相关。因此，低分组比高分组具有更强的免疫反应。

Figure 6

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细胞焦亡模型在Anti-PD1/PD-L1免疫治疗中的作用

作者首先在ACRG队列和TCGA-STAD队列中检查了不同细胞焦亡模型免疫检查点的表达变化，发现低评分组免疫检查点基因表达水平较高，即免疫治疗效果较好(图7A)。然后，作者使用肿瘤免疫功能障碍和排斥(Tumor Immune Dysfunction and Exclusion, TIDE)计算框架，来模拟肿瘤免疫逃避的两种主要机制，提供免疫治疗的预测结果。TIDE升高预示患者具有抑制T细胞浸润的抑制性细胞，对免疫治疗无反应。作者发现TIDE和细胞焦亡评分之间存在正向关联(图7B)。作者再次证明了评分越高，预后越差(图7C-E)。

虽然缺乏抗PD1/PD-L1免疫治疗在胃癌中的研究，作者在其他三种癌症中发现，细胞焦亡评分模型可以很好地预测黑色素瘤患者和转移性肾细胞癌患者的1年生存率，以及转移性尿路上皮癌患者的2年生存率(图7F)。作者在其他癌症的队列数据中也发现低评分组免疫检查点的表达较高(图7G)。以上结果都暗示，细胞焦亡评分模型是一个在泛癌中普遍适用的预测指标。

Figure 7

小编总结

相比于其他细胞焦亡基因构建预后模型的文章，本文的亮点在于使用多个队列的数据包括来自临床的真实数据，反复验证自己模型的可靠性，并推广到其他胃肠道癌症中。作者多次从临床角度出发，阐述焦亡基因构建的预后模型的意义和效果，并显著优于其他模型。本文工作全面而且细致，尤其使用多队列多维度数据验证自己的想法非常值得我们借鉴。