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PNAS:大规模并行筛选合成微生物群落

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Listenlii-生物信息知识分享
发布2022-03-31 21:38:43
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发布2022-03-31 21:38:43
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Published:June 11, 2019.

Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6600964/

PNAS:大规模并行筛选合成微生物群落

Published onlineJune 11, 2019.

Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6600964/

注:

去年看到一篇Science advances文章,在其他公众号已有翻译:

【MicroE精读】可培养细菌间正相互作用更为常见

其中用了kChip高通量微生物筛选平台,感觉比较厉害,于是看了一下。

摘要

建立了一个基于液滴的平台kChip,可以进行快速、大规模并行、自下向上的合成微生物群落构建和筛选。

在由19个土壤分离物组成的约10万个多物种群落中,确定了促进模式植物Herbaspirillum frisingense生长的共生菌群落,他们对碳源变化和其他物种的存在具有强大的适应性。

kChip可以识别具有任何功能的多物种组合,包括抑制病原体或降解难降解基质,用于生物燃料生产或环境修复等。在基础和应用微生物生态学中有许多应用。

背景

高通量表型筛选已经被广泛用于新基因靶点和药物的发现,但由于构建菌株组合的复杂性,其应用受到了阻碍。

传统的液体处理技术和平台(例如,在多孔板中以移液器为基础的组合)可能不足以在单个实验中提供足够的样品组合空间。例如,从一个只有n = 16个菌株的文库中,要在一个培养基中产生k ={1,2,…,7}大小的所有子集,需要大约160,000个液体处理步骤和275个96孔板(无重复)。

由于这些组合不能提前准备,而且必须在细胞分裂的时间尺度(约1小时)上进行组合,因此即使产生10%的这些组合在逻辑上也可能不现实。由于构建每个群落需要一套独特的液体输送装置,这些实验也很难实现自动化。

事实上,在液体介质中进行的组合研究通常<103个独特的合成群落。一些最大的组合研究使用Burkholder琼脂试验代替,将一组n个微生物菌落引入用第二种菌种接种的琼脂凝胶中,每个琼脂平板产生n × 1个组合。使用这种分析方法的单一研究可以产生103-104个相互作用,但通常限于二元组分。菌落之间的扩散进一步对菌落阵列的密度和屏幕的输出量设置了一个上限。

本研究提出了kChip平台,解决了实验规模和时间要求,以高通量检测微生物群落功能。kChip系统每天可以并行构建和定量筛选约105个合成微生物群落,不需要机器人处理液体。

n- multichoice -k表明每个群落由k个输入(例如,菌株,培养基)组成,这些输入是随机从一个更大的文库n中选择,其中n和k都由用户选择。kChip平台推广了一种高密度微孔阵列方法,可将纳升的液滴分组并合并。液滴根据微孔几何形状随机自组装成k ={1,2,…,7,19}组,大大减少了组合装配的时间和复杂性。与其他液滴微流体系统一样,kChip平台适用于荧光和无标签的光学分析,并使用小体积。此外,kChip微孔的长度尺度(约100 - 1000 μm)是相互作用驱动的微生物群落组装的自然生态尺度。

方法

微生物培养基输入准备

所有的细菌培养都经历了一个最初的“起始阶段”,将甘油储存和环境分离菌株和荧光标记菌株分别接种到525μL和4ml的LB培养基。随后“预培养阶段”在M9最小培养基(MM)中洗涤细胞,初始OD600为0.01。“实验阶段”包括清洗和重悬细胞,通常的初始OD600为0.02 (或每个微滴约20个细胞)。

kChip输入预处理

每个液滴都含有Hf-GFP,一个共培养的分离物和一个碳源。在产生液滴之前,每个输入都会收到一个“颜色代码”,即独特比例的三种荧光染料。每一次输入都接收到0.05% (wt/vol)的牛血清白蛋白,以帮助在液滴汇集和负载期间保留疏水性小分子。

生成液滴和进入kChip

液滴在Bio-Rad的QX200液滴发生器上使用氟碳油产生。液滴汇集在一起,制备总数为200μL的液滴悬浮液(约5分钟),并注入定制的kChip加载装置中。每个微孔随机取样k滴(~ 5-10分钟)。将kChip放大2倍扫描,根据其颜色编码(~ 12-15分钟)来识别每个微孔中的液滴。液滴通过暴露于交流电场(4.5 MHz, 10000 - 45000伏)实现融合。

结果

kChip快速构建大规模并行群落

(A)运行kChip,首先产生1-nL液滴。每个液滴包含一个颜色代码(三种荧光染料的特定比例),该颜色代码对应于相应的输入。液滴汇集后,将液滴加载到kChip上,液滴随机分组进入微孔中。这些微孔被设计成精确分组k个液滴。对kChip进行成像,从液滴颜色代码中识别出每个微孔的内容。然后,通过暴露在交流电场中,液滴在各自的微孔中合并,产生平行的合成群落。群落表型可通过光学分析进行跟踪,包括荧光蛋白表达和呼吸驱动的还原刃天青产生试卤灵。(B)显示了不同类型微孔液滴的分组和合并。微孔在kChip上密集排列,微孔密度与尺寸(k)成反比。单个微孔类型可以在kChip上排列(Full kChip)。对于图3和图4中的应用,生成了一个k ={1:7;19}芯片,其中包括平行排列的不同微孔类型。

标记菌株和未标记菌株的生长可以跨环境条件进行分析

kChip允许在环境条件(例如,抗生素、天然产物、碳源)文库中对荧光标记和未标记菌株进行快速功能性分析,具有灵活的时间分辨率(仅受kChip扫描时间的限制,2倍放大时<15分钟)。为了比较kChip与传统方法的性能,获得了液滴培养板和常规96孔板培养板(SpectraMax平板)的碳利用率曲线[即在最小培养基中,不同单一碳源的每种菌株的生长曲线]。在kChip上,将一个含有微生物的液滴库与一个含有碳源的液滴库合并在一起,并将这些液滴装载到一个k = 2的芯片上(即kChip上的所有微孔都将两个液滴组合在一起)。从每个库接收一滴微孔的微孔中(约占总微孔的1/2,或约1.7万个微孔),分析了每个碳源上每种菌株的生长情况。

为了追踪生长,使用了两种方法中的一种:(i)测定组成型荧光蛋白[绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)]或(ii)通过细胞代谢(与细胞密度成正比)将刃天青染料还原为荧光产物试卤灵,可用于未标记或基因上难以处理的菌株的无标记试验。结果表明,在k = 2的芯片和96孔板上,由GFP或YFP信号产生的碳利用率剖面与芯片一致性有很强的相关性(Pearson r = 0.868)

在k = 2芯片上测量标记菌株和未标记菌株的碳利用曲线。(A)液滴文库可由荧光标记菌株文库和一组碳源制成。每个菌株在每个碳源上生长的能力可以通过监测接收一个含微生物液滴和一个含碳源液滴的微孔来测量。(B)为了测量未标记菌株的生长,在液滴产生前(合并后浓度为40μM)将染料resazurin添加到碳源输入中。在具有代谢活性的细胞存在的情况下,Resazurin被还原为荧光产物间苯二酚。(C)我们测量荧光板的10株荧光(OD600 = 0.02开始)在15个条件[13碳源为0.5% (wt /卷),一个额外的葡萄糖复制控制,和一个负面的控制(无碳)]在k = 2芯片microwells(21°C,没有摇晃)以及200 -μL文化96 -孔板(21°C, 220 rpm)。heatmap显示了50h时的相对信号,交叉列对应于kChip和96孔板(Pearson r = 0.868)(全时过程见SI附录,图S6)。(D)我们在k = 2芯片微孔(21°C,无振荡)的四种碳源条件下,测量了三种菌株(起始OD600 = 0.005)的resazurin信号(荧光,由于间苯二酚积累),并将这些信号与96孔板(21°C, 220 rpm)中200-μL培养物的OD600测量值进行了比较。热图显示了22小时的信号(Pearson r = 0.969)。

kChip筛选鉴定出对Herbaspirillum frisingense生长有强烈促进作用的成分

kChip一个应用是发现促进或抑制感兴趣菌株生长的成分。此外,可以同时评估这些成分在非生物环境中的稳健性和额外环境分离菌株的存在。

kChip高通量筛选识别出了对碳源和群落环境具有稳定促进活性的植物成分。

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原始发表:2022-02-02,如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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