7分+ | 又是一个利用【单细胞公共数据库】发文章的新思路

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研究背景和设计

1.研究背景：

三阴性乳腺癌 (TNBC) 对新辅助化疗 (NAC) 的耐药性是一项重大的临床挑战。因此，描绘TNBC异质性可以提供对耐药机制和潜在治疗靶点的新见解。

最近研究描述了两类 TNBC 患者对 NAC 的反应。

• “克隆灭绝”：根据 NAC 治疗前后的突变分析，其表现出肿瘤细胞克隆在治疗后的消失；表明这些患者对NAC治疗有反应
• “克隆持久性”：基于 DNA 突变分析某些肿瘤克隆存在于 NAC 之前，随后响应 NAC 治疗而富集；表明这些患者对NAC治疗缺乏反应。

2.研究设计：

• 在本研究中，作者使用了各种计算流程（迭代聚类和引导基因选择 [ICGS]、统一流形逼近和投影 [UMAP] 降维和独创性路径分析 [IPA]）来描绘 TNBC 异质性并确定它们在单细胞水平上对 NAC 的反应。
• 来自单细胞分析的数据在TNBC 患者（360 名患者）中得到进一步验证，从而确定了预测 TNBC 无复发生存期（RFS）的三基因特征。
• 进一步使用 MDA-MB-231 和 BT-549 TNBC 模型验证了无响应组基因与紫杉醇 (PTX) 抗性有关，提出将它们作为 TNBC 预后标志物和治疗靶点的潜在用途。

研究设计和研究方法示意图

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材料和方法

1.数据来源和生物信息学

• SRA数据库：下载单细胞原始RNA-seq数据，登录号为SRA：SRP114962
• 差异基因分析

2.基因富集和基因相互作用网络构建

4.Kaplan-Meier、Cox回归生存分析

5.TNBC细胞培养、小干扰 RNA (siRNA) 介导的基因沉默作为单一试剂或与紫杉醇 PTX (20 nM) 组合进行转染

6.对照和 siRNA 转染细胞的细菌菌落总数（CFU） 测定和 PTX 敏感性

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主要试验结果

1. 单细胞RNA测序和ICGS揭示NAC前后TNBC的异质性

为了研究单细胞水平的 TNBC 异质性，作者首先分析了 NAC 治疗前后分类为响应者（n = 4）和无响应者（n = 4）的单细胞转录组数据。并采用了 ICGS2 算法进行聚类，进一步无监督转录组分析确定了 13 个簇，每个簇具有不同的分子特征。C1和C12主要存在于治疗前和治疗后无响应者中（图 1A）。

为了进一步选择特征和描绘细胞群，作者对来自相同细胞群的数据进行 UMAP 降维分析，结果显示共有 13 个集群（图 1B）。值得注意的是，基于密度的 C12 和 C1 聚类在其他聚类中显示出明显的独特模式，没有重叠。

图 1. 通过 ICGS2 和 UMAP 对 TNBC 衍生的单细胞在 NAC 前后的降维分析揭示的 TNBC 单细胞的异质性

(A) 使用 ICGS2 算法对NAC前：719 灭绝（响应者）和 525 持久性（无响应者）的单细胞和NAC后：894个灭绝（响应者）和687个持久性（无响应者）单细胞的数据进行聚类。数据显示为热图，左侧图例中显示了丰富的细胞群，顶部显示了相应的单细胞簇。色标显示差异基因表达 (log2)。下面的图例表示细胞起源

(B) UMAP 降维分析揭示了 NAC 前后的 13 个细胞簇。EXT_POST，NAC 后灭绝；EXT_PRE，消光前NAC；PER_PRE，持久性 pre-NCA；PER_POST，NAC 后的持久性。

2.单细胞转录组的比较分析提示：响应和无响应组存在显著的基因表达和GO差异

为了探索与 NAC 抗性相关的基因特征，比较了治疗前后三阴性乳腺癌衍生单细胞的响应组和无响应组的转录组差异（图2A）。使用火山图反映了响应组和无响应组之间的差异表达基因（图2B）。

为了验证从发现队列中获得的数据，作者在其他队列验证了top10个上调和top10个下调基因，结论也与之前相似（图2C和2D）。

图 2. TNBC 衍生单细胞在 NAC 前的响应组和无响应组中的转录景观比较分析

(A) TNBC 衍生的单细胞从响应 (n = 534) 和无响应 (n = 781) 组 pre-NAC 的层次聚类 . 每列代表一个细胞，每一行代表一个基因。根据色标描述单个细胞中每个基因 (log2) 的表达水平。

(B) 火山图说明了 NAC 前响应与无响应组中上调 (红色) 和下调 (蓝色) 基因。在由 782 个响应和 535 个无响应 TNBC 衍生的单细胞组成的第二组中验证前 10 个上调 (C) 和前 10 个下调 (D) 基因。

3.创新路径分析（IPA）显示：响应组和非响应组存在功能类别、途径方面存在显著差异

为了更好地了解响应组和非响应组中的生物过程，作者对治疗响应组或无响应组中上调/下调的基因置于IPA中进行富集分析，揭示了每组中几种典型途径的激活（图3A/B）。

进一步的IPA下游效应分析(DEA)揭示了许多可能受转录组数据影响的下游生物学功能。

作者采用 IPA 中的调节器效应器分析对响应组与非响应组TNBC 中上调的基因进行分析。确定了7个上游调节因子和35个基因层次结构的中间体，它们共同驱动致癌表型，例如细胞周期、增殖迁移和侵袭（图3D）。

最终确定了几种激活（FOXM1、NOTCH1 和 MYC）和抑制（肿瘤坏死因子 [TNF] 和 IFNG）信号级联作为非响应组中预测的致癌表型的潜在驱动因素。

图 3. 响应组与非响应组差异表达基因的独创性通路分析（IPA）

（A-B）在响应组与非响应组TNBC中，基于上调(A)和基因下调(B)的富集典型通路。

(C)树图（层次热图），基于上调的基因描述了受影响的功能类别，其中主要的盒子代表了一个疾病和功能的类别。响应组中最丰富的功能类别是细胞运动和细胞生长和增殖。

（D）基于IPA的调控因子效应网络分析，强调了激活(GNA12、PI3K家族、IGFBP2、STAT3和EGFR)和抑制(COL18A1和LONP1)上游调控因子的作用及其在预测致瘤功能中的作用。

4.治疗响应组中免疫细胞的差异

响应组中富集基因集的IPA分析主要涉及免疫细胞运输和细胞间信号相互作用（图4A）。随后，作者进一步确定了响应组和非响应组中的免疫相关差异基因（图4B）。

为了探索响应组和非响应组中免疫浸润细胞的功能是否存在差异，作者对来自CD45+EPCAM− 细胞的转录组进行IPA分析，结果表明响应组的免疫细胞功能增强，无响应组中免疫浸润细胞的功能受损（图4C和4D）。

图4.免疫浸润是响应组的标志。

(A) 树状图 (分层热图) 描述了基于持久性组 (在灭绝组中上调) 中下调基因的受影响功能类别，其中主要框代表疾病和功能的类别。下图显示了免疫细胞运输以及细胞间信号传导和相互作用的说明。

(B) 响应组：①治疗前：CD19、CD8A、CD4、CD52、CD2、CD53、CD59、CD47、CD74和CXCL9的表达更高；②在治疗后：免疫浸润细胞数量下降；无响应组：却观察到相反的情况，在治疗后浸润免疫细胞的数量增加；且治疗后 CD74+ 细胞的数量显着增加

描绘免疫细胞运输 (C) 和血液系统发育和功能 (D) 的激活的树状图 (分层热图)。

5.单变量和多变量无复发生存分析

作者根据前面的分析确定了788个上调基因和244 个下调基因，随后进行Kaplan-Meier生存分析。

随后使用Cox回归模型进行了多变量分析，并确定了三基因特征（KIF5B高-HLA-C低-IGHG2低）作为RFS的最佳预测因子（图5C）。

图5。360例TNBC患者的单变量和多变量无复发生存分析。

（A）无响应组：上调的CD55、KIF5B、ZFAS1、CAMTA1、LRPPRC、RSL24D1、NEBL、COXC6、PTK2、TCEA1、GDI2、NUDT5和CD46与较差的RFS有关

（B）响应组：上调的IGHG2、IGHM、IGLC1、HLA-C、IGHG4、IGHGP、ITGB2、HLA-DPB1、HLA-A和SLAMF7显示出更好的预后

（C） 三种基因标记（KIF5Bhigh-HLA-Clow-IGHG2low）的预后价值是明确的。

6.针对性的沉默无响应组基因，可减少TNBC集落形成，并增强PTX的敏感性

为了进一步深入了解驱动基因及其在PTX耐药中的作用，作者根据基因特征及其生物学通路的差异，选择了10个上调基因并使用siRNA 对它们进行沉默，基因功能丧失抑制了 MDA-MB-231 和 BT-549 TNBC 模型的菌落-形成单位（CFU）的潜力，并提高了无响应组对紫杉醇的敏感性。

图6。选定的持久性衍生基因的靶向耗竭在体外抑制TNBC CFU潜能。

(A) 10个上调的BYSL、FDPS、ENO1、MED20、MRPL9、NDUFB11、PMVK、MYC和GSTP1在源自响应组 (782细胞) 和非响应 (535细胞) TNBC的第二个单细胞队列中得到验证，这与第一个实验队列一致；

(B) 来自CCLE数据库的一组TNBC细胞系中选定的10个基因的表达，表明它们适合作为研究这些基因功能的细胞模型

(C-D)用指示的siRNA作为单一试剂或与紫杉醇 (PTX; 20 nm) 组合转染后，MDA-MB231 (C和D) 或BT-549 (E和F) 的克隆形成潜力。数据代表了一式两份进行的两个实验。

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小结

三阴性乳腺癌是浸润性乳腺癌，作者利用已有的单细胞测序公共数据结合目前研究热点【耐药】进行转录组景观分析。文章分析思路新颖，干湿结合，7分+也不足为怪咯。研究过程中：

• 作者使用了各种计算流程（迭代聚类和引导基因选择 [ICGS]、统一流形逼近和投影 [UMAP] 降维和独创性路径分析 [IPA]）来描绘 TNBC 异质性并确定它们在单细胞水平上对 NAC 的反应。
• 来自单细胞分析的数据在TNBC 患者（360 名患者）中得到进一步验证，从而确定了预测 TNBC 无复发生存期（RFS）的三基因特征。
• 进一步使用 MDA-MB-231 和 BT-549 TNBC 模型验证了无响应组基因与紫杉醇 (PTX) 抗性有关，提出将它们作为 TNBC 预后标志物和治疗靶点的潜在用途。