单个样品测序了近2万个单细胞怎么办
众所周知，10x技术推荐单个样品产出5-8K的细胞，在10x的官网也有如下所示的表格解释：
Multiplet rate (%) | # of Cell Loaded | # of Cell Recovered |
|---|---|---|
0.40% | 800 | 500 |
0.80% | 1,600 | 1,000 |
1.60% | 3,200 | 2,000 |
2.30% | 4,800 | 3,000 |
3.10% | 6,400 | 4,000 |
3.90% | 8,000 | 5,000 |
4.60% | 9,600 | 6,000 |
5.40% | 11,200 | 7,000 |
6.10% | 12,800 | 8,000 |
6.90% | 14,400 | 9,000 |
7.60% | 16,000 | 10,000 |
理论上细胞数量太多，造成的麻烦就是双细胞比例提高，但是真实情况下往往是一切其它指标都很差，比如:
- Estimated Number of Cells，估计检测到的高质量细胞数
- Fraction Reads in Cells，在高质量细胞的序列数百分比
- Mean Reads per Cell，每个高质量细胞的平均序列数
- Median Genes per Cell，每个高质量细胞的基因数中值
- Total Genes Detected，所有细胞检测到的基因总数
- Median UMI Counts per Cell，每个高质量细胞的平均 UMI 数
但是目前大家很喜欢要求公司多测一点，所以一万个细胞左右也能勉强接受。但是怕就怕实验环节出问题了，测序2万个单细胞甚至更多，就麻烦了。
我看到文章《Single-Cell RNA Sequencing of Peripheral Blood Mononuclear Cells From Pediatric Coeliac Disease Patients Suggests Potential Pre-Seroconversion Markers》, 也是单个样品测序了近2万个单细胞：In total, 19,663 single cells were profiled.
所以，严苛的质量控制步骤就很关键了，如下所示：
After quality control by filtering based on possible doublets, the number of genes expressed (included cells with >200 and <3,000 genes) and low quality cells (included cells with <15% mitochondrial transcript reads)(Supplementary Figure 1), we retained 9,559 cells for subsequent analyses.
近2万个单细胞，过滤后是不到1万，挺好的。其中 (Supplementary Figure 1), 如下所示：
可以看到，作者的过滤参数并不严苛，都是很常规的，而最主要的过滤效果来源于每个细胞需要有大于200个基因被检测到，这个再平凡不过了。但凡是大家读取10x的单细胞转录组数据，都是默认设置了这个过滤参数（min.features = 200 ），代码如下所示：
library(Seurat)
# https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz
## Load the PBMC dataset
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
## Initialize the Seurat object with the raw (non-normalized data).
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k",
min.cells = 3, min.features = 200)
所以，现在你还在担心你的单细胞数据质量吗？
另外，我处理了这个文章《Single-Cell RNA Sequencing of Peripheral Blood Mononuclear Cells From Pediatric Coeliac Disease Patients Suggests Potential Pre-Seroconversion Markers》,的附件给出来了的表达量矩阵，确实是质量会有一点点小问题，但是降维聚类分群和生物学命名问题不大：
降维聚类分群和生物学命名
很容易看出来不同免疫细胞的分群：
#定义细胞亚群
celltype[celltype$ClusterID %in% c(7,8,12,15),2]='Myeloids'
celltype[celltype$ClusterID %in% c(0,1,2,9,10,11),2]='CD4'
celltype[celltype$ClusterID %in% c(4,5),2]='CD8'
celltype[celltype$ClusterID %in% c(3,6,14),2]='Bcells'
celltype[celltype$ClusterID %in% c(13),2]='plasma'
绝大部分文章都是抓住免疫细胞亚群进行细分，包括淋巴系（T,B,NK细胞）和髓系（单核，树突，巨噬，粒细胞）的两大类作为第二次细分亚群。
这个也是可以继续细分，但是文章选择了走大量差异分析和注释的路线去讲故事。其实这样的基础认知，也可以看基础10讲：
- 01. 上游分析流程
- 02.课题多少个样品，测序数据量如何
- 03. 过滤不合格细胞和基因（数据质控很重要）
- 04. 过滤线粒体核糖体基因
- 05. 去除细胞效应和基因效应
- 06.单细胞转录组数据的降维聚类分群
- 07.单细胞转录组数据处理之细胞亚群注释
- 08.把拿到的亚群进行更细致的分群
- 09.单细胞转录组数据处理之细胞亚群比例比较
最基础的往往是降维聚类分群，参考前面的例子：人人都能学会的单细胞聚类分群注