结直肠上皮细胞单细胞亚群

结直肠癌单细胞数据集也有十多个了，拿到表达量矩阵后的第一层次降维聚类分群通常是：

• immune (CD45+,PTPRC),
• epithelial/cancer (EpCAM+,EPCAM),
• stromal (CD10+,MME,fibo or CD31+,PECAM1,endo)

参考我前面介绍过 CNS图表复现08—肿瘤单细胞数据第一次分群通用规则，这3大单细胞亚群构成了肿瘤免疫微环境的复杂。比如 EMBO Mol Med (2021) 的文章《 Mitogen-activated protein kinase activity drives cell trajectories in colorectal cancer 》，就是如此：

第一层次降维聚类分群

绝大部分文章都是抓住免疫细胞亚群进行细分，包括淋巴系（T,B,NK细胞）和髓系（单核，树突，巨噬，粒细胞）的两大类作为第二次细分亚群。但是也有不少文章是抓住stromal 里面的fibo 和endo进行细分，并且编造生物学故事的。

反而是上皮细胞，大家很少涉及到，但是结直肠癌既然是来源于结直肠这样的组织， 它的上皮细胞就不可能是一个纯粹的上皮，理论上是可以细分的。上面的这个文章其实也接下来部分细分，如下所示：

上皮细胞的细分亚群

可以看到，肿瘤的上皮细胞首先需要区分恶性与否，然后各自降维聚类分群和生物学命名，目前区分恶性与否比较权威的工具是infercnv。我们早期大量关于使用infercnv来推断肿瘤单细胞转录组数据里面的拷贝数的教程：

• CNS图表复现09—上皮细胞可以区分为恶性与否
• CNS图表复现13—使用inferCNV来区分肿瘤细胞的恶性与否
• CNS图表复现14—检查文献的inferCNV流程
• CNS图表复现15—inferCNV流程输入数据差异大揭秘
• CNS图表复现16—inferCNV结果解读及利用
• CNS图表复现17—inferCNV结果解读及利用之进阶

一般来说，恶性的肿瘤细胞分群只能是靠生物学特征，顺序编号即可，它不是正常细胞，异质性很大，也没有办法给出来一个通用的生物学名字。

但是正常的肠道上皮细胞有多种类型，包括肠吸收细胞、杯状细胞、Tuft细胞、潘氏细胞、肠分泌细胞等。

我在学徒作业：7种肠道正常上皮细胞亚群标记基因是否有可取之处也提到过，2021年发表在Cell 杂志的文章：《Differential pre-malignant programs and microenvironment chart distinct paths to malignancy in human colorectal polyps》把上皮细胞首先区分成为了恶性的癌症细胞，主要是：

• ASC – adenoma specific cells,
• SSC – serrated specific cells

以及正常的上皮细胞，normal epithelial cells包括：

• 吸收细胞（ABS，absorptive cell）
• 隐窝顶部结肠细胞（CT，crypt top colonocytes）
• 内分泌细胞（EE enteroendocfine cells）
• 杯状细胞 （GOB，goblet cells）
• 干细胞（STM，stem cells）
• 过渡放大细胞（TAC，transit amplifing cells）
• 肠道簇细胞（TUF，tuft cells）

如下所示的降维聚类分群：

另外，发表在Sci Adv, 2022的文章：《mA mRNA modification maintains colonic epithelial cell homeostasis via NF-κB-mediated antiapoptotic pathway》，是小鼠模型， 该研究有7863个上皮细胞进行单细胞转录组测序，降维聚类分群后进行生物学命名，如下所示：

降维聚类分群后进行生物学命名

可以看到是7个单细胞亚群，包括：

• Stem cell marker gene, Lgr5 (A
• TA cell marker gene, Mki67 (B
• DCS cell marker gene, Reg4 (C, Kit (D
• Tuft cell marker gene, Dclk1 (E
• Colonocyte marker gene, Alpi (F
• Enteroendocrine cell marker gene, Chga (G
• Goblet cell marker gene, Spdef (H).

文章链接是：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abl5723 感兴趣的可以读一下，其单细胞表达量矩阵也是公开可以获取的，见：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE171423

我们整理了基因集，代码如下所示：

library(ggplot2) 
genes_to_check = c( "OTOP2","MEIS1","KRT20","GUCA2A",
                    "ALDOB","MSLN","MUC5AC","AQP5","TACSTD2",
                    "FSCN1","TFF2","ANXA1","ANXA10","REG4","MUC17",
                    "S100P","GSDMB","GSDMD","L18","RELB","MDK","RARA",
                    "RXRA","AHR","AGRN","PDX1","CLDN2","CD44","AXIN2",
                    "RNF43","TGFBI","EPHB2","TEAD2","CDX2","LGR5",
                    "OLFM4","ASCL2","PCNA","MKI67","ATOH1",
                    "MUC2","TFF3","CHGA","NEUROD1","POU2F3","SOX9")

有意思的是，我把前面的 EMBO Mol Med (2021) 的文章《 Mitogen-activated protein kinase activity drives cell trajectories in colorectal cancer 》，里面的正常组织的上皮细胞拿出来进行细分的时候，发现是；

可以看到

• 内分泌细胞（EE enteroendocfine cells） 是第16群，数量很少，代表基因是 "CHGA","NEUROD1"
• 杯状细胞 （GOB，goblet cells）的群比较多，是7,8,11,14 ，代表基因是："ATOH1", "MUC2","TFF3"
• 隐窝顶部结肠细胞（CT，crypt top colonocytes）是5和12，代表基因是："OTOP2","MEIS1",

剩下的，我就不一一举例说明了。可以看到， 这些基因还是蛮有效果的，在肠道上皮细胞的单细胞细分亚群水平。

当然了，这样的生物学认知还需要自己深入这个领域。

练习题

我给几个数据集给大家，去试试看，能不能从里面把上皮细胞拿出来，并且进行细分亚群，看看能不能有上面列出来的亚群。

• 2020-GSE132465-CRC
• 2021-60多个crc病人的180个样品（GSE178341）

其实这样的基础认知，也可以看基础10讲：

• 01. 上游分析流程
• 02.课题多少个样品，测序数据量如何
• 03. 过滤不合格细胞和基因（数据质控很重要）
• 04. 过滤线粒体核糖体基因
• 05. 去除细胞效应和基因效应
• 06.单细胞转录组数据的降维聚类分群
• 07.单细胞转录组数据处理之细胞亚群注释
• 08.把拿到的亚群进行更细致的分群
• 09.单细胞转录组数据处理之细胞亚群比例比较

最基础的往往是降维聚类分群，参考前面的例子：人人都能学会的单细胞聚类分群注释