Nat Commun. | 单细胞+空间转录联合分析肿瘤微环境浸润细胞间的相互作用

通过单细胞测序可以最大程度的反映细胞的异质性，发现新的细胞群和细胞亚群，并为阐明细胞状态转换的调控机理提供了技术保障。但是，常规单细胞转录组测序技术丢失了细胞在原组织中至关重要的空间位置信息，而单细胞和空间转录组结合可以弥补这个遗憾，帮助研究人员探索肿瘤异质性和肿瘤微环境(TEM)的复杂相互作用。

今天小编就给大家带来一篇2022年4月发表在Nat Commun上的一篇文章，该研究作者便是将单细胞联合空间转录组分析揭示了FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞在结直肠癌中的相互作用。

Nat Commun. 2022 Apr 1;13(1):1742. doi: 10.1038/s41467-022-29366-6.

研究摘要

结直肠癌 (CRC) 是最常见的恶性肿瘤之一，除手术外，其治疗方法有限。肿瘤微环境 (TME) 分析有助于发现潜在的治疗靶点。

在该研究者，作者确定了结直肠癌中存在多样化的肿瘤微环境景观，其中FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞在肿瘤组织中富集。此外，进一步强调了浸润FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞高度相关，它们的存在与淋巴细胞浸润呈负相关，并预测患者存活率低。

这种相互作用通过免疫荧光染色和空间转录组学方法得到验证，它们的共存与丰富的细胞外基质表达有关，从而促进肿瘤促纤维增生结构的形成并限制T细胞的浸润。此外， FAP或SPP1的高表达有助于对 PD-L1 阻断免疫治疗产生耐药性。

总之，这项工作揭示了基质和巨噬细胞亚群之间复杂的相互作用，通过破坏FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的相互作用来改善免疫治疗，从而提供了一种潜在的治疗策略。

研究结果

1.构建人类正常黏膜和结直肠癌组织的单细胞转录组图谱

• CRC 患者（结肠腺癌n  = 2；直肠腺癌n  = 3）的正常黏膜和肿瘤组织制作单细胞悬液，经质控、标准化、PCA分析，再使用Harmony将肿瘤和邻近正常组织的 scRNA-seq 数据进行整合，随后用UMAP进行可视化，构建单细胞转录组图谱。
• 五名患者的肿瘤和邻近正常组织中均都存在所有九种主要细胞类型（图1e），但是每种主要细胞类型的浸润程度不同，这可能反映了 CRC 进展阶段的差异。

图1.构建人类正常黏膜和结直肠癌组织的单细胞图谱。

(a)本研究设计的图形概述。

(b)来自 5 名 CRC 患者的正常粘膜的 29,481 个细胞和来自肿瘤组织的 24,622 个细胞的 UMAP 图，每个图中显示 9 个簇。

(c)显示指定细胞簇中已知标记的平均表达的点图。点大小代表每个簇中表达基因的细胞的百分比。显示了标记的表达强度。

(d)CRC 患者正常和肿瘤组织的 UMAP 图中所示的 54,103 个未分选细胞中选定的已知标记基因的表达水平。

(e)显示了在不同供体（左图）、组织（中图）和每种细胞类型的总细胞数（右图）中以条形图显示的 9 种主要细胞类型的比例。

2.CRC患者肿瘤组织中细胞亚群的特征揭示了TME的标志性特征并于临床结果相关。

• 作者利用分子特征数据库 (MsigDB) 的标志基因集来分析相邻正常组织和肿瘤组织之间浸润的的MSC（间充质干细胞）、EC（心肌细胞）、神经胶质细胞、骨髓细胞、T 细胞和B 细胞亚群调控网络的变化（图 2a）；
• 来自肿瘤的 MSC、EC 和骨髓细胞中缺氧的标志性基因组更富集（图 2a）。这些特征可能反映了位于肿瘤缺氧区域的基质细胞相互作用，该相互作用将巨噬细胞、MSCs 和 ECs 连接起来以重塑 CRC 微环境；
• 与来自正常黏膜的细胞相比，肿瘤浸润性骨髓细胞和 T/ILC 表现出更多的代谢相关基因富集（图2a)，表明免疫代谢在 CRC TME 中被重新编程。总之，这些发现表明主要细胞类型的调节途径是在 CRC TME 中形成的。
• 鉴于scRNA-seq样本量有限，作者使用反卷积算法 CIBERSORTx构建特征矩阵分析bulkRNA，揭示了 MSCs 浸润与 TME 中骨髓细胞浸润之间呈正相关。
• 进一步评估 CRC TME 中每种细胞类型浸润的临床相关性，发现MSCs或骨髓细胞浸润较高的患者与较差的 OS（d）和 PFS（e)有关。

图 2.间充质干细胞和骨髓细胞在肿瘤浸润中呈正相关并与临床结果相关。

(a）肿瘤和邻近正常组织之间的全局细胞类型中差异表达基因的 50 个标志的点图。

(b）CRC队列中成对细胞类型浸润的相关性。

(C)散点图显示了 14 个具有 CRC 的独立数据集的 MSCs 和骨髓细胞浸润之间的相关性.

(d、e ）Kaplan-Meier 曲线显示，在 TCGA COAD/READ 队列中，MSCs（左）或骨髓细胞（右）浸润较高的患者与较差的 OS（d）和 PFS（e)有关 。

3.肿瘤特异性FAP+成纤维细胞与结直肠癌进展相关

• 肿瘤邻近组织和肿瘤组织之间浸润细胞类型的差异表明，TME 的动态重塑在 CRC 进展中起重要作用。作者研究发现CRC肿瘤样本中FAP +成纤维细胞的浸润显着增加，而NT5E +和FGFR2 +成纤维细胞的浸润显着减少；
• 然后，作者进行了 RNA“速度”分析，推断FAP +成纤维细胞的分化轨迹，发现肿瘤特异性FAP +成纤维细胞可能起源于FGFR2 +成纤维细胞或ICAM1 +端粒细胞。
• FAP +成纤维细胞的分化由复杂的转录因子 (TF) 网络协调，这些转录因子通过与其辅因子和下游基因相互作用来调节彼此及其效应子。因此作者进一步分析FAP +的分化成纤维细胞由复杂的转录因子 (TF) 网络协调。
• 为了了解FAP +成纤维细胞与其两种潜在前体的分化受到调节，又分析了差异表达的基因并进行了 KEGG 富集分析。

图 3.正常粘膜和肿瘤组织中基质细胞的表征。

a.显示按簇着色的 MSC 组成的UMAP。红色虚线圆圈显示FAP +成纤维细胞。

b.条形图显示 scRNA-seq 中每个 MSCs 亚型的百分比。

c. 在 scRNA-seq中比较成对的正常粘膜 ( n  = 5) 和肿瘤 ( n = 5) 组织中FAP + MSCs 成纤维细胞的频率。

d.配对正常和肿瘤之间FAP +成纤维细胞绝对浸润比例的比较

e.按FAP +成纤维细胞浸润分层的 COAD 患者的 Kaplan-Meier 无进展生存曲线。

f.小提琴图显示选定基因的表达。

g.代表性流式细胞仪图（左）和正常黏膜（n  = 6）和肿瘤（n  = 6）组织中FAP +成纤维细胞（右）的比例。

h. MSCs 亚型的 RNA 速度。推断的FAP +成纤维细胞的发育轨迹是红色圆圈并放大（向下）。

i.热图显示了每个 MSCs 亚型中前 5 个转录因子 (TFs) 基因的相对表达 (z-score)，如 ( a ) 所示。

j.热图显示 pySCENIC 预测的 MSCs 亚型中前 5 个 TF 调节子的标准化活动。对FAP +成纤维细胞具有最高活性的 TF 调节子以红色标出。

ķ -m.UMAP 图显示TWIST1 ( k ) 的表达、TWIST1-调节子 ( l )的活性和HI1α信号通路的富集评分 ( m )。

4.肿瘤特异性SPP1+巨噬细胞与CRC进展相关

• CRC 患者骨髓细胞的重塑表明这些细胞在肿瘤发生中具有功能性作用，鉴定了三种树突状细胞（DC）亚型;
• 通过研究邻近组织和肿瘤组织中骨髓细胞亚型的变化，发现肿瘤样品中SPP1 +巨噬细胞的浸润显着上调。且具有较高SPP1 +巨噬细胞浸润的 CRC 患者表现出较短的 PFS（图4e）；
• 此外，分化轨迹预测肿瘤特异性SPP1 +巨噬细胞可能起源于THBS1 +巨噬细胞（图4g）
• 为了进一步确定SPP1 +巨噬细胞的主要调节因子，通过pySCENIC 分析，结果表明，STAT1编码是巨噬细胞向 M1 表型倾斜的主转录因子，且在SPP1 +巨噬细胞60中具有高度活性（图 4i-l）。在SPP1 +巨噬细胞中高度表达的基因是那些参与 ECM-受体相互作用、PPAR 信号通路和糖酵解/糖异生的基因。
• 作者假设存在基质细胞介导的网络，位于肿瘤的缺氧区域，连接巨噬细胞和 MSC，它们协同加剧了 CRC 微环境。

图 4.正常粘膜和肿瘤组织中骨髓细胞的表征。

5.FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的高浸润与较差的患者生存率相关

• FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞主要富集在肿瘤组织中，并且在 14 个结直肠癌数据集的患者中发现了 MSCs 和骨髓细胞浸润之间的高度相关性（图2b）。
• 使用 CIBERSORTx 评估了 scRNA-seq 在 14 个独立 CRC 队列中识别的 58 个细胞簇的浸润，并进一步计算了每个队列中这些细胞簇浸润内的成对 Spearman 相关性。发现FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞是所有检查队列中相关性最高的群体。此外，具有高FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的患者表现出最短的 PFS，这表明这两种细胞类型可以协同促进肿瘤进展。
• 随后作者进行GSEA 分析，发现高表达的FAP +成纤维细胞和高表达的SPP1 +巨噬细胞富集到EMT以及TNFα 信号传导和 IL2/STAT5 信号传导途径。
• 通过 H 评分系统评估了 78 名 CRC 患者的组织微阵列 (TMA) 中的蛋白质表达水平，以确定与邻近正常组织相比，肿瘤组织中的 FAP 和 SPP1 均特异性增加且表现出较短的 OS（5f）。
• 作者进一步检查了FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞是否紧密定位在 CRC 组织中。免疫荧光标记表明 SPP1 阳性和 FAP 阳性细胞在 CRC 组织中非常接近（图 5I, j)，这意味着这两个细胞之间存在潜在的串扰。

图 5.(A)FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的高浸润与较差的患者生存率和免疫治疗抗性相关。

a饼图显示14 个独立 CRC 队列中成对 58 种细胞类型浸润的相关性。

b使用 Kaplan-Meier 曲线按FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞浸润分层的四个 TCGA-COAD 患者亚组的进行性无生存分析。

c. FAP +成纤维细胞高/ SPP1 +之间的上皮-间质转化、缺氧、TNFα 信号通路的 GSEA 和 IL2巨噬细胞高组和FAP +成纤维细胞低 / SPP1 +巨噬细胞低组。

d , e相邻正常 ( n  = 78) 和 CRC 组织 ( n  = 78) 微阵列中 FAP ( d ) 和 SPP1 ( e ) 染色强度的量化。

f - h Kaplan-Meier 曲线显示了单独低表达和高表达 FAP ( f )、单独 SPP1 ( g ) 和两者 ( h ) CRC 患者的总体生存分析。

i CRC 组织的代表性 IF 染色 (20x)。实验在三名独立患者中进行。

j与 SPP1 阳性细胞共定位的FAP +成纤维细胞的比例（ n  = 9，3 个切片的 3 名患者）。

6.空间转录组学揭示FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的细胞间相互作用

• 进一步对 4 名 CRC 患者的肿瘤组织切片进行空间转录分析，结果表明促纤维细胞微环境可能受到FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞相互作用的调节，以限制免疫细胞浸润到肿瘤核心。

图6.空间转录组学揭示了FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的共定位。

a.CRC 患者 #6 中 ST 点组织切片的苏木精和伊红 (H&E) 染色。比例尺，500 μm。对一个肿瘤切片重复实验两次。

b ST 点的无偏聚类并定义每个聚类的细胞类型。

c点图显示指定细胞簇中已知标记的平均表达。

d – f组织切片 ( d )的 H&E 染色、ST 点的无偏聚类 ( e ) 和显示CRC 患者 #7中指定细胞簇 ( f ) 中已知标记物的平均表达的点图为 ( a– c ) 所示。对一个肿瘤块重复 H&E 染色两次。

g – i组织切片中FAP +成纤维细胞 ( g )、SPP1 +巨噬细胞 ( h ) 和上皮细胞 ( i )特征评分的空间特征图。

j , k患者#6中FAP +成纤维细胞/ SPP1 +巨噬细胞簇中FAP +成纤维细胞（x 轴）和SPP1 +巨噬细胞（y 轴）的特征评分的 Pearson 相关性（ j) 和患者#7 ( k )。

l. GO分析4名患者FAP +成纤维细胞/ SPP1 +巨噬细胞簇中显着富集

m.患者#6 组织切片中CD3D、CD8A、CD4、CD19、MS4A1、GZMA、PRF1和GNLY基因表达的空间特征图。

7.FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞相互作用可能有助于促纤维增生性肿瘤微环境

• 作者为了进一步确定CRC 患者中FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞相互作用的关键介质，研究了FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的细胞间通讯机制。
• 结果表明FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞形成了一个相互作用网络，支持彼此的维持和功能。这两种细胞类型可能在 ECM 的重塑中发挥重要作用，可能促进 TME 促纤维增生区的形成。

图7.FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞之间的相互作用网络。

a . NicheNet 的 MSCs 亚型中顶级预测配体表达的热图，用于预测由调节SPP1 +巨噬细胞的FAP +成纤维细胞表达的配体（左）。底部，不同骨髓亚型上相关受体表达的热图。中间， FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞之间重要配体-受体对的热图。FGFR2 +成纤维细胞或ICAM1 +成纤维细胞作为配体-受体分析的参考细胞类型。b , c .UMAP 图显示RARRES2的相对表达MSCs 亚型 ( b ) 和CMKLR1骨髓细胞亚型 ( c )。

d.比较健康供体（ n  = 17，蓝色）和 CRC 患者（n  = 20，红色）血浆中凯莫瑞浓度的统计分析。

e.根据 NicheNet推断，排名靠前的配体通过SPP1 +巨噬细胞调节FAP +成纤维细胞。

f点图显示排名靠前的配体的表达百分比（点大小）和强度（点强度）（e) 在每个骨髓亚型中。

g.配体-受体对显示SPP1 +巨噬细胞和FAP +成纤维细胞之间的相互作用，按配体活性排序 ( e )。

h.热图显示FAP +成纤维细胞中排名前 20 的配体 ( e ) 和下游靶基因的调节潜力。

i.富集在FAP +成纤维细胞中表达的预测靶基因的代表性 KEGG 途径。通过Fisher检验进行统计分析。

j显示前 3 个活性配体网络的图表（由TGFB1编码，IL1A和IL1B）用于属于 ECM 和潜在信号通路的靶基因。

8.FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的高浸润与免疫治疗抗性相关

• TME 可分为三种不同的类型，包括炎症型（其中免疫细胞浸润但被抑制）、免疫排斥型和免疫沙漠型。在该研究中，作者剖析了 CRC 免疫排斥微环境产生的潜在机制。
• 作者对具有不同FAP +成纤维细胞和/或SPP1 +巨噬细胞浸润模式的肿瘤的局部免疫特征进行分析，发现FAP或/和SPP1的高表达的患者有着更短的生存时间以及对抗 PD-L1 治疗的反应明显低于其他患者。

图 7.TME 中淋巴细胞的浸润和受SPP1 +巨噬细胞和FAP +成纤维细胞影响的患者对 PD-L1 阻断的反应。

(a – i) TCGA-COAD 患者四个亚组的非沉默突变率 ( a )、SNV 新抗原 ( b )、TCR 香农指数 ( c )、TCR 丰富度 ( d ) 和淋巴细胞浸润 ( e ) FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的浸润;

(f – h)使用 Kaplan-Meier 曲线（IMvigor210 队列）在抗 PD-L1 免疫治疗队列（IMvigor210 队列）中单独FAP（ f）、单独SPP1（ g）和两个（ h ）患者组的低和高表达的生存分析

i.条形图显示FAP低表达的患者和SPP1更有可能对抗 PD-L1 治疗产生反应。

j. FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞之间的免疫排除生态位和串扰模型的工作模型。

小结

该研究证实了FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞有助于 ECM 重塑并协调形成阻止淋巴细胞浸润肿瘤核心的促纤维增生微环境，进一步降低 PD-L1 治疗的功效。揭示了 CRC 微环境中免疫和非免疫细胞的详细情况，并强调了识别和开发针对FAP +成纤维细胞、SPP1 +巨噬细胞或参与其串扰的分子的治疗策略以克服免疫抑制和增加肿瘤对免疫疗法的反应。