CLL中Ibrutinib应答的时间动力学

文献信息

题目：Chromatin mapping and single-cell immune profiling define the temporal dynamics of ibrutinib response in CLL 期刊：nature communication 日期：2020年1月 DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-019-14081-6 数据集：GSE111104

文献基本内容

研究背景：

布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂依鲁替尼（ibrutinib）为慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者主要的治疗药剂。

依鲁替尼（ibrutinib）是Johnson Johnson公司和Pharmacyclics公司合作研发的靶向抗癌新药，于2013年11月13日获美国食品药品管理局（FDA）批准上市，商品名为Imbruvica,该药用于套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma, MCL）的治疗

研究目的

为了确定依鲁替尼主要的调节动力学。

研究方法

结合免疫表型、单细胞转录组分析和染色质图谱分析依鲁替尼治疗CLL患者的高分辨率时间过程。

研究思路

确定了一个一致的调控程序，从CLL细胞中NF-κB结合的急剧减少开始，随后是lineage-defining转录因子的活性降低，CLL细胞身份的侵蚀，以及获得静止样基因特征。

研究在 CLL 患者中抑制 BCR 信号传导诱导的细胞动力学和调节程序，在 240 天的标准化时间过程中跟踪了从依鲁替尼治疗开始的 7 个人。每日相同剂量的依鲁替尼（ibrutinib）的治疗，接受了广泛的临床监测。

结果

对于所有患者和最多八个时间点（伊布替尼治疗开始后的 0、1、2、3、8、30、120/150、240 天），通过外周血单个核细胞 (PBMCs) 的流式细胞术分析进行免疫表型分析），系统地量化细胞组成对依鲁替尼治疗的反应。

CLL 细胞的逐渐减少与非恶性自然杀伤 (NK) 和 T 细胞群百分比的增加相吻合，这种趋势对于 CD8+ T 细胞最为明显，CD4+ T 细胞基本不受影响。

流式筛选marker gene

• B cells (CD19+CD5-CD38-),
• CD4+ T cells (CD3+CD4+),
• CD8+ T cells (CD3+CD8+),
• CLL cells (CD19+CD5+),
• gamma-delta T-cells (CD3+CD4-CD8-),
• myeloid cells (CD3-CD19-CD14+),
• NK cells (CD3-CD19-CD56+),
• NK-T cells (CD3+CD8+CD56+),
• T cells (CD3+)

对于依鲁替尼诱导的基因表达变化的系统分析，对一部分患者和时间点的总 PBMC 群体进行了单细胞 RNA-seq（补充数据 4），约 43,000 个单细胞转录组通过了质量控制（补充图 3a、b），以进行无监督降维并使用 UMAP 方法将其整合到二维图中（图 1e）。

scRNA的细胞类型与通过流式细胞术获得的细胞类型几乎完全相关（Spearman's ρ = 0.95）

基于 scRNA-seq 数据，能够推断出患者特异性拷贝数畸变（图 1f），其确定了特征性 CLL 特异性染色体畸变，包括染色体 11q 和 17p 的缺失，以及染色体 12 的三体性。

每个样本和细胞类型的细胞转录组与患者相应的预处理（第0天）样本，发现了对依鲁替尼治疗的分子反应的细胞类型特异性趋势（图1g，h和补充图4）

依鲁替尼靶标 BTK、CD52（CLL 疾病活动标记物 29）和 CD27（B 细胞活化调节剂 30）的表达降低。在非恶性免疫细胞类型中，CD8+ T 细胞受到的影响最大，其中包括对免疫细胞激活很重要的基因如 CD28、JUN 和 ZAP70 的下调。

CD4+ T 细胞在较小程度上共享这种模式，而 CD14+ 细胞显示出 NF-κB regulator NFKBIA 的强烈上调。超越单个基因，通过量化与 CLL 和免疫相关的基因和转录组来表征对依鲁替尼的反应（图 1i 和补充图 5、6）。

CLL 细胞中 B 细胞特异性基因的强烈下调，包括 NF-κB 亚基 RELA 和 NF-κB1 以及 NF-κB 相关转录因子 ATF2 和 SPI1/PU.1 的靶基因组。参与氧化磷酸化的基因也被下调，这与依鲁替尼治疗下 CLL 细胞中细胞活性的广泛抑制一致。

在非恶性免疫细胞类型中，CD8+ T 细胞表现出广泛的下调，虽然不太明显，但与在 CLL 细胞中观察到的反应相似；

CD14+ 单核细胞/巨噬细胞表现出炎症反应特征的特异性上调，包括干扰素 γ、TNF 和 NF- κB信号。

CLL 中 NF-κB 信号传导的下调和 B 细胞表面标志物的丢失，这表明这些是 CLL 细胞分数随时间逐渐减少的关键因素，观察到非-CLL 免疫细胞伴随着 CD8+ T 细胞分数的增加。

为了剖析依鲁替尼诱导的CLL细胞转录组和免疫表型变化的调节基础，在依鲁替尼时间过程中对FACS纯化的CD19 CD5细胞进行了ATAC-seq

将时间进程建模为高斯过程 (一种用于处理时间序列数据的统计方法)，并确定了响应依鲁替尼的染色质可及性发生显着变化的6797基因区域 (补充数据7)。

在这些基因组区域中检测到四个主要簇 (图2b) :

• (i) 逐渐失去染色质可及性的区域 (n = 3412);
• (ii) 逐渐获得染色质可及性的区域 (n = 2199);
• (iii) 遵循双峰的区域，振荡模式 (n = 369);
• (iv) 以依鲁替尼治疗开始后约30天染色质可达性峰值为特征的区域 (n = 354)。

通过LOLA软件 (图2c) 的区域集富集分析推断了这四个集群的推定调控作用。

• 簇1 (染色质可及性降低) 强烈富集了在淋巴分化和基因调控中起作用的转录因子的结合位点，以及对CLL细胞和/或b细胞具有特异性的增强子。
• 簇2富集了b细胞和T细胞特异性增强剂 (染色质可及性增加)。
• 簇3 (双峰，振荡染色质可及性) 富集了NF-κ b结合位点。
• 簇4在造血细胞中以组蛋白H3K36me3标记的转录区域富集(在第30天左右染色质可及性达到峰值)。

为了确定依鲁替尼诱导的CLL细胞状态调节的潜在调节因子，文章专注于富集的转录因子 (来自图2c)，并估计它们在依鲁替尼时间过程中整体结合活性的变化，在每个因子的推定结合位点上聚集ATAC-seq信号 (基于公开可用的ChIP-seq数据)。

涉及B细胞发育 (包括NF-κ B和PAX5) 和B细胞增殖 (包括MEF2C和FOXM1) 的几个关键转录因子显示在其结合位点的染色质可及性显著降低

这种作用在CLL细胞和非恶性b细胞之间共享，而在其他免疫细胞类型中未检测到。

染色质可及性和细胞类型特异性转录的综合分析进一步证实了这个观点。

对转录因子及其假定的结合位点进行富集分析 (图2e) 时，观察到b细胞发育关键调控因子如BCL11A、EBF1、IKZF1、IRF4、MEF2A、NFATC1、PAX5和POU2F2的协同变化，表明BTK抑制可能会触发CLL细胞中b细胞身份的丧失。

为了支持这种解释，文章在CLL细胞中，依鲁替尼治疗后整体b细胞特异性基因表达特征持续下调 (图2f和补充图8b)

依鲁替尼治疗一天后，CLL细胞在NF-κ b结合位点的染色质可及性降低。随后，NF-κb 调节 (PU.133，IRF434，35) 或与NF-κ b (ATF236) 相互作用的转录因子结合位点的染色质可及性逐渐降低。并且观察到b细胞特异性调节活性降低，包括在b细胞特异性调节区域和b细胞转录因子 (如BCL11A，NFATC1和RUNX3) 结合位点的染色质可及性降低。这些结果突显了NF-κ B介导的B细胞身份丧失。

免疫细胞亚群获得类似静止的基因特征

为了表征依鲁替尼治疗对非恶性免疫细胞基因调控的影响，文章通过对 FACS 纯化的 CD19+CD5- B 细胞、CD3+CD4+ T 辅助细胞、CD3+CD8+ 细胞毒性 T 细胞、CD56+ NK 细胞进行了 ATAC-seq ，以及来自相同患者和时间点的 CD14+ 单核细胞/巨噬细胞，这五种细胞类型中确定了总共 12,574 个时间动态调节区域。

无监督聚类检测到五种类型的非恶性免疫细胞的共享时间动态，随着时间的推移，染色质可及性区域组显示逐渐减少或增加，以及一个双峰、波浪状的簇，其特征是初始减少，然后是随后的染色质可及性的增加。

总结：

• 文章利用流式细胞术、scRNAseq 和ATAC-seq在六种 FACS 纯化的细胞类型中应用于开始依鲁替尼治疗的 CLL 患者的密集时间过程检测。
• CLL 细胞中 NF-κB 结合基因的减少，随后参与 B 细胞发育和功能的转录因子（如 EBF1 、FOXM1、IRF4、PAX5 和 PU.1)表达下降。伴随着（并且可能确实导致）CLL 特异性基因特征的下调和 CD5 和 CD19 等表面标志物水平的下降，共同表明 CLL 细胞特性的广泛侵蚀。
• 依鲁替尼诱导的变化并非 CLL 细胞独有，而是与其他免疫细胞类型共有;
• 不表达 BTK 的免疫细胞类型的这些变化可能是由于 ibrutinib 对 BTK 以外的激酶（包括 BLK、BMX、ITK、TEC、TXK 和 EGFR43）的混杂抑制的直接影响和由 依鲁替尼诱导 CLL 细胞从保护性微环境迁移到外周血中;
• 文章侧重于对依鲁替尼的反应的特定方面，包括减少增殖、减少细胞-细胞接触和下调 NF- κB。