文献精读-植物地上组织维持表达斑图稳态的跷跷板模型

这篇文章是2022年6月份发表在Science Advance上的文章，主要是讲的通过对地上的形态组织的极性基因进行研究，明确了其信号转导的作用。

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原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abn0368

doi：10.1126/sciadv.abn0368

该研究是由北京大学的焦雨玲教授和张磊教授团队完成。

研究背景

在器官发育中，蛋白斑图还有相关的拮抗的基因对其形态建成具有重要的影响作用。

在动物和植被的研究中，器官发育受到了精确的图案化调控，因此也被称为斑图。

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在植物的地上组织发育的时候，主要是受到了顶端分生组织的调控，也被称为SAM，那顶端分生组织在后期也不断的分化成为了叶原基和花原基。

可以发现当叶形相关的一个基因发生了突变后，对整个植物的叶形都发生了一定的影响，并观察其叶原基和花原基的形成 ，都受到了相关的影响，甚至影响到了后期的果实的发育及形成。

Du Fei et al，2020.png

那通过对植物的叶原基和花原基进行连续的观察发现，叶原基和花原基是一个处于精确的图案化调控的发育过程中。

Yasunori Ichihashi et al， 2011

那这些原基因此通过后续的发育的器官组织不同，也划分成了不同的区域，主要可以划分成近轴域和远轴域。

Bowman JL， 2000.png

在这些调控到近轴域和远轴域的基因是非常多的，同时是相互抑制的。通过荧光表达和数学建模成像，发现主要在近轴域表达的基因是REV基因，在远轴域主要表达的基因是KAN1。

Yu T et al, 2017.png

那控制近轴域的基因还有经典的WUS-CLV基因，还有在远轴域中抑制KAN1的表达，进而使得MICRO165及MICRO166表达上升，在远轴域不断表达。

Yadav RK et al, 2013;Tatematsu K et al, 2015.png

那生长素做为一个极性运输的驱动，在整个植物体的生长发育中占有重要的主导作用，因此在原基的形成中也是扮演着重要的角色，通过对拟南芥和番茄的原基进行荧光成像，发现生长素一直处于高表达的水平。

Wang et al, 2014.png

除却以上的基因对原基的发育具有重要的作用，还有相当多的基因对原基的发育也起到调控作用，如MP和PRS基因，都是受到生长素响应基因，同时还有WOX1基因，那这些基因在原基的近轴域和远轴域的调控中，都是起着相互抑制的功能。

Du et al, 2018.png

因此基于以上及课题组的前期研究，作者就提出了一个科学问题，这些在功能是具有相互抑制的基因，在进行对原基调控的时候是如何发挥相关的功能？

结果

量化近轴-远轴界面位置

为了对原基的发育进行研究，选择了拟南芥的花原基进行连续72小时的活体成像，观察相关的细胞水平的变化。通过对细胞进行观察，发现伴随着时间的不断延长，相同的细胞逐渐向外围发育，同时发现在原基出现的区域pin的表达值是最高的。

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同时伴随着原基的不断发育，pin值最大的表达位置也发生移动，并且出现了第二原基，而且这个时候前面已经提到的近远轴域的基因KAN1 、REV的表达区域也趋于稳定，因此作者猜想生长素的不断积累会诱导这个近远轴界面的分离。

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就选择了两个典型的响应生长素调控突变体Pin1-1和arf5-1突变体去观察REV-KAN1的分界面是不是会产生变化。通过对突变体进行荧光观察后，发现rev的表达区域还是被KAN1基因的表达所包围，因此就可以通过生长素表达积累最多的地方去预测近远轴域的分界面。

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描述原基中的跷跷板模型

同时已经有前人对原基中的近远轴域的基因进行研究，发现两者是呈现一个此消彼长的情况，因此联想到了数学模型-跷跷板模型。

首先通过对原基进行观察，发现在出现第三原基的时候，原基的细胞层出现了6-9层的变化，因此在模型构建的时候主要选择6-9个细胞层进行模拟，随后又选择了符合相关的模型-希尔函数，结合常积分函数，构建了不同的模型进行阐述。

首先是模型1，选择KAN1及REV基因两个变量，发现伴随着时间的延长，KAN1对REV的强烈抑制导致REV表达水平较低，使得KAN1的表达量最高，占满整个原基，不符合REV-KAN1基因的跷跷板模型。

因此在 前期的研究中得到生长素相关的基因会对整个原基的生长具有重要的作用，因此作者又加入了两个受到生长素响应的基因MP及PRS，对这四个变量模型模拟。

首先是MP直接调控PRS，PRS基因对REV及KAN1进行调控。

发现在这种模型中，也是不符合跷跷板模型，使得远轴域覆盖了整个原基。

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基于以上，作者猜想是否MP基因直接调控KAN1及REV基因，因此又做了两种模型假设，在MP对REV进行调控的时候，一个是对KAN1不调控，一个是对KAN1的表达具有抑制作用，在这两种模型下，都发现严重抑制了KAN1基因的表达，使得近轴域的基因 覆盖了整个原基的。当MP基因共同调控KAN1及REV基因的时候，使得出现与实验一致的植物表型。

基于以上，作者获得了适合原基近远轴域表达模式的模型图。

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MP基因的表达位置

基于以上的研究结果，作者发现在调控近远轴域的基因种，mp基因起到了介导的作用，因此猜测是否MP基因与KAN1及REV基因是不是直接调控的。

首先对MP基因的表达位置进行实验，通过前期对拟南芥的叶原基的MP基因的表达位置进行研究发现MP的表达位置覆盖了整个KAN1-REV基因的表达域。因此本研究中所选用的是拟南芥的花原基材料，因此又对MP基因的表达位置进行了重复，发现是一样的结果，因此对上述的猜想有了初步的认证。

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既然该基因与MP基因的表达位置又重叠，那是否规避掉生长素的响应元件，使得MP基因直接与两个基因发生作用呢，因此作者选择了一个pMP:MP-GR转基因株系，对生长素响应不敏感，其中重要是缺少两个MP基因的domin，发现植株在经过放线菌酮处理后，经过qpcr实验，发现KAN1和REV基因的表达量上升，因此猜测MP基因可能是直接与REV及KAN1基因作用。

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REV和KAN1的启动子分析

既然该基因是直接与这两个基因结合，因此猜测是否这两个基因的启动子区域是含有MP基因的结合位点，对两个基因的启动子进行分析发现，是由一些响应生长素的位点的，因此又做了chip-qpcr实验，使用两个基因的启动子去结合mp基因的抗体，发现又一部分的序列是有富集的，其中KAN1基因中的那个富集较高的基序是响应生长素的元件区域。因此作者得出一个结论，mp基因应该是与结合的序列有关。

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那为了验证两个基因的启动子是否对MP的响应十分重要，又在原生质体中进行了luc实验，去查看两个基因的表达量，因此就得到在植株中两个基因的含量上升。同时截去基因一部分的基序后发现该基因不能与mp基因结合。

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那既然MP基因缺少含有生长素元件的区域都可以诱导这两个基因的表达上升，那生长素的含量上升是不是也会有影响。因此作者通过干扰模型中的动力学参数值，发现在模型5的条件下，无论是值发生什么样的改变，而且生长素含量的变化，都不会改变模型的稳定性。

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REV和KAN1模型的稳定性

因此作者又在实验中想要对这个模型是不是稳定性进行验证，发现在2，4D的施加24h后，发现REV结构域在茎顶端略有扩大，而KAN1结构域却受到影响，然而，REV-KAN1界面仍然在原基内。

同时进行qpcr实验后，发现对原基诱导4小时后，发现KAN1的表达水平升高，但诱导16小时后，KAN1的表达水平恢复到原来的水平。

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因此就选择了两种方式对刚刚的现象进行验证，首先选择了不含有MP基因中的一个domin的植株(除去该基因响应生长素的条件)与pREV:REV- Venus植株进行杂交，观察后代中原基的表型，发现近轴域的区域面积不断增大。

同时又选用pKAN1m:KAN1-GFP株系，是一个与MP结合的AuxREs的特异性缺失/突变的转基因材料，通过观察植物的原基结构，发现与野生型相比，远轴域的表达位置较少，因此上述结果表明，MP基因的过量表达会诱导两个基因的表达量发生变化。

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近远轴域间的基因关系

得到上述的结果，是明显与前面的模型不符的，因此就为了获得是不是MP基因与REV基因之间还有别的相互作用，因此选择构建了arf5-rev10d的双突变体，去观察植株的表型，发现在双突中的表型与arf5植株的表型相比，出现了絮状的花原基的组织，则表明当MP促进REV表达时，异位REV表达可能部分挽救部分的MP活性，因此两个基因是存在相互作用的。

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尤其是获得了wox1-2 prs rev-6的三突变体后，发现无论是叶还是花的结构，与单突或者双突相比都出现了一定的缺陷，表明这三个基因是具有协同作用，共同调节近远轴域得分界面。

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原基形态发生调控网络中其他基因的调控关系

原基发育是一个复杂的调控网络，除了作者研究的这四个基因外，还有很多基因对原基的图案化调控具有重要的作用，因此作者也对其他的基因了研究。

首先是选择了p35S:FLAG-GR-REVd，去观察植株的micro基因的表达变化，发现KAN1远轴域基因的表达受到了抑制，而其他的几个近轴域的基因表达上升，也在原生质体中进行了试验进行验证，也得到了相同的结果。因此表明PRS/ WOX1和KAN1之间的相互抑制关系影响它们的表达水平。

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作者同样选择了植株对材料进行了验证，得到了一样的结果，表明PRS/WOX1与REV具有协同作用，抑制KAN1表达。因此，在原始形态发生的基因调控网络中存在多个反馈回路。

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根据上述的结果，作者又将前面的模型5进行修正，发现在延长时间后(1200h)后，发现REV-KAN1模式中MP的低REV表达是稳定的，但MP中高REV表达不是稳定的。相反，REV-KAN1模式中MP诱导的KAN1高表达是稳定的。因此mp对kan1具有调节作用，但是kan1不能促进mp的表达。

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总结

基于上述结果，作者就明确了MP基因对于原基发育的重要性，提出了MP调控REV及KAN1基因来共同调控原基的图案化的过程。

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参考文献

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