喻志强/姚广裕/王康男Adv Sci：AIE 分子的非辐射和辐射衰减的动态调整加强 NIR-II 成像介导的光热治疗和免疫治疗

关键词：AIE、CD39-CD73-A2AR、免疫原性细胞死亡、NIR-II、光热疗法

正文：南方医科大学喻志强、南方医科大学南方医院姚广裕、南方医科大学顺德医院王康男在国际学术刊物《Advanced Science》(IF: 16.806)在线发表了一种智能纳米递送系统，能够光热杀伤肿瘤细胞，同时通过NIR-II成像进行手术导航，成功实现了化疗和免疫治疗的协同治疗。论文题为 “Dynamic Adjust of Non-Radiative and Radiative Attenuation of AIE Molecules Reinforces NIR-II Imaging Mediated Photothermal Therapy and Immunotherapy” (DOI: 10.1002/advs.202104793)。作者合成了一种具有近红外二区 (NIR-II) 成像和光热特性的新型AIE分子，命名为TST。NIR-II (1000–1700 nm) 具有更深的组织穿透力 (高达15 mm)，这导致比NIR-I (700–900 nm) 具有更高的成像分辨率。喜树碱 (CPT) 是一种具有大量共轭双键的喹啉生物碱类细胞毒药物。将CPT和PEG通过酯化反应形成两亲性化合物，中间具有氧化还原敏感性单硫接头 (CPT-S-PEG)。CPT-S-PEG、TST和AZD4635采用纳米沉淀法制备自组装纳米粒。由于 CPT 和TST之间的强相互作用，TST的非辐射衰减受到抑制，当纳米颗粒完整时产生更强的NIR-II荧光。随着癌细胞摄取纳米颗粒，氧化还原敏感的 CPT-S-PEG 被降解并且纳米颗粒分解。释放的TST由于摆脱了CPT的限制，增强了非辐射衰减，加速了光热转换。此外，由于光热作用使肿瘤部位的温度升高，肿瘤细胞经历了ICD。释放的CPT抑制DNA拓扑异构酶在化疗中发挥作用，释放的AZD4635抑制CD39-CD73-A2AR通路增强免疫治疗。

图1. 设计了一种智能纳米递送系统，能够光热杀伤肿瘤细胞，同时通过NIR-II成像进行手术导航，成功实现了化疗和免疫治疗的协同治疗。

一、TST纳米粒子的表征

CPT-S-PEG、TST和AZD4635采用纳米沉淀法制备自组装纳米粒。DSPE-NP的光热效率低可能是由于纳米颗粒中的TST处于聚集状态，而强烈的分子间相互作用限制了TST的分子内旋转和伸缩振动，抑制了非辐射能量衰减，因此降低光热转换效率。然而，氧化还原敏感的 CPT-S-PEG 可以被环境中高浓度的 H2O2 降解，导致纳米颗粒的崩解并释放TST。释放的TST缓解了对非辐射衰减的抑制，因此CAT-NP的加热曲线与TST Sol的加热曲线基本一致。CAT-NP 的光热性能取决于激光功率。随着激光功率从0.25提高到2 W cm-2，在连续激光照射 5 分钟后，纳米粒子系统的最终温度从32.7 °C升高到68.8 °C。

图2. TST纳米粒子的表征。A) 在 1 W cm-2的808 nm激光照射下，水、TST-Sol、DSPE-NP 和 CAT-NP 的温度变化。B) 808 nm激光照射不同功率下CAT-NP的温度变化。C) 不同浓度的 CAT-NP 在 1 W cm-2的808 nm激光照射下的温度变化。D) CAT-NP 在三个连续的808 nm激光照射和冷却循环期间的温度变化。E）通过CAT-NP的动态光散射 (DLS) 和透射电子显微镜 (TEM) 图像测量的纳米颗粒尺寸，比例尺：200 nm。F) 相同浓度的 TST-Sol、DSPE-NP和CAT-NP在808 nm激光激发后的发射荧光强度曲线。G) 相同浓度的 TST-Sol、DSPE-NP和CAT-NP在808 nm激光激发后的NIR-II图像。H) C-NP在1 mmH2O2和10 mm H2O2 (n = 3) 中的 CPT 释放曲线。I) 水、TST-Sol、DSPE-NP和CAT-NP在1 W cm-2下用808 nm激光照射的光热图像。

二、TST纳米粒子的体外细胞摄取和抗肿瘤能力

为进一步探索TST纳米粒的抗肿瘤作用，对4T1细胞系进行了一系列初步研究。作者首先通过MTT法研究了四种纳米粒子的细胞毒性，有或没有808 nm激光照射作为对照。结果表明，四种纳米粒子的细胞毒性呈浓度依赖性，即纳米粒子浓度越高，细胞毒性越强。不同之处在于没有负载TST的纳米颗粒 (C-NP和CA-NP)，激光照射与否对其细胞毒性影响不大。然而，载有TST的纳米粒子 (CT-NP和CAT-NP) 在激光照射后表现出更强的细胞毒性，尤其是CAT-NP，在激光照射后对肿瘤细胞的杀伤作用最强。随后通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜研究了纳米颗粒的细胞摄取。经过相同时间的共孵育，纳米粒组的细胞摄取效率高于游离药物组，这可能是由于纳米粒小而均匀的尺寸更利于内吞作用。并且通过蛋白质印迹法验证了不同纳米颗粒引起的免疫原性细胞死亡和凋亡。

图3. 纳米颗粒的体外细胞摄取和抗肿瘤能力。A) C-NP、B) CA-NP、C) CT-NP和 D) CAT-NP的细胞毒性，有或没有激光照射 (n = 6)。E) 通过激光共聚焦扫描显微镜获得的游离Cy5.5、DSPE-NP和CPT-NP的细胞摄取图像 (蓝色：Hoechst 33342 染色的细胞核，绿色：FITC-鬼笔环肽染色的细胞骨架，红色：Cy5.5，比例尺：20微米)。F) 通过流式细胞仪测得的游离Cy5.5、DSPE-NP和CPT-NP的细胞摄取。G) 不同纳米颗粒处理的4T1细胞的WB结果。

三、TST纳米粒子的体内抗肿瘤功效研究

为了进一步研究TST纳米粒在体内的抗肿瘤作用，将 4T1-荧光素酶 (4T1-Luc) 细胞接种于Balb/c小鼠的腋下皮下。当肿瘤达到 100 mm3 时，将不同的纳米颗粒通过尾静脉注射对小鼠进行治疗。所有纳米制剂在体内均具有令人满意的安全性。根据小鼠的生存曲线，除 DSPE-NP 和 CAT-NP 组外，其他组的小鼠在开始治疗后18天内死亡。然而，CATNP组治疗30天后的存活率为75 %，DSPE-NP组的存活率为37.5 %。由于肿瘤模型接种了4T1-Luc细胞，因此静脉注射D-荧光素底物后，可以通过小动物活体影像系统直接观察小鼠的肿瘤大小。治疗后第0天、第4天、第8天和第12天直接观察肿瘤体积。结果表明CAT-NP治疗效果最佳。

图4. 不同纳米颗粒的体内抗肿瘤功效研究。A) 治疗计划示意图。B) 4T1-Luc荷瘤小鼠肿瘤的生长曲线。C) 小鼠体重变化曲线。D) 荷瘤小鼠的生存曲线。E)各组肿瘤生长曲线。F) 0、4、8、12天静脉注射D-荧光素后的小动物生物发光图像。黑色背景意味着鼠已死亡。

四、TST纳米粒子的体内免疫治疗效果

经TST治疗后，肿瘤细胞中细胞毒性T淋巴细胞浸润增加，抑制了MDSC。同时，TST可有效影响CD39-CD73-A2AR通路，从而激活对肿瘤的强烈免疫应答。

图5. 不同纳米颗粒在体内的免疫治疗效果。A) 通过流式细胞术检测肿瘤部位的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)。B)通过流式细胞术检测肿瘤部位的髓源性抑制细胞 (MDSC)。通过ELISA (n = 6) 测定肿瘤微环境中 C) ATP和D) 腺苷的含量。E) AZD4635影响CD39-CD73-A2AR通路的示意图。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/advs.202104793

通讯作者介绍：

喻志强，博士，教授，博士生导师，博士后合作导师，曾担任先进生物材料PI团队主任。2010年长崎大学药学院获药学博士, 2011年1月起在美国亚利桑那州立大学Sidney Hecht课题组开展博士后研究，主要研究博来霉素肿瘤药物合成和作用机制的研究。2015年7月受聘于南方医科大学生物药剂学科教授。其主要研究兴趣包括新型铂药纳米制剂，癌症诊疗一体化，智能响应小分子前药纳米制剂，美容活性分子和健康特膳食品的研究。近年来以一作或者通讯在Adv. Mater, J. Am. Chem. Soc, ACS Nano, Nano Letters, Adv.Funt.Mater, Advanced Sci, JMC, Biomaterials, Small, Biosens Bioelectron, Nano Res，APSB，JCR, Bioact Mater等国际期刊发表SCI论文60余篇，11篇为ESI高被用论文, 19年以来以通讯作者发表IF大于10研究论文13篇。论文总引用约4400多次，H因子39，主持10多项省部级科研基金。担任Adv Mater, ACS Nano, Adv.Funt.Mater, Chem Sci, Biomaterials, Theronostic, JMC等多个国际主流杂志评审专家。国家自然科学基金评审专家；中国抗癌协会纳米肿瘤学会青年委员；中国生物医学工程委员会青年委员；中国药剂学专业委员会青年委员；中国化学快报编委；AJPS杂志青年编委；药学学报A/B青年编委；广东省精准医学运用学会纳米医学分会副主任委员。

姚广裕，南方医院乳腺科副主任医师，博士研究生导师。毕业于中山大学，获博士学位。2018年荣登广州中青年实力医师榜，2019年荣登胡润·平安中国好医生榜。现任中国抗癌协会肿瘤微创治疗委员会乳腺学组常务委员、广东省中医药学会乳腺病专业委员会副主任委员、广东省保健协会乳腺保健分会副主任委员、广东省基层医药学会乳腺微创重建专业委员会副主任委员。主要参与国家十二五课题一项，主持国家自然科学基金面上项目1项、省级基金多项；以通讯/共同通讯在Advanced Materials、Adv Funct Mater、Biomaterials、Nanomedicine等杂志发表SCI论文10余篇。授权实用新型专利4项。目前担任《南方医科大学学报》和《中山大学学报医学版》特约审稿人。