通过单细胞分析支气管肺泡灌洗液区分COVID-19轻症和危重症

研究背景

为了阐明先天性和适应性宿主免疫系统是如何恶化COVID-19免疫病理。本文使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合T细胞受体测序（TCR-seq）和B细胞受体测序（BCR-seq）共同绘制了COVID-19肺炎的全面深度免疫图谱，分析了31例轻症或危重症COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液（BAL）样本，同时与非COVID-19肺炎和正常肺的BAL进行了比较。构建了T细胞、单核细胞到巨噬细胞的轨迹，该研究为区分非特异性肺局部炎症信号和COVID-19特异性肺部相关免疫变化提供了可靠的依据。

方法流程

研究结果

1.scRNA-seq分析BAL的细胞类型

对24例SARS-CoV-2 肺炎患者（其中2名“轻度”和22名“重度”患者）和13例非COVID-19肺炎的BAL样本进行scRNA分析，得到65166个细胞，其中51%的细胞来自COVID-19患者。降维聚类分析后得到16种细胞类型，分别为淋巴系细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞和浆细胞。髓系细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞（cDC)、中性粒细胞和肥大细胞。上皮细胞包括肺泡Ⅱ型上皮细胞、分泌细胞和纤毛细胞等。通过整合Liao等人关于COVID-19 BAL的scRNA-seq数据(包括3名“轻度”和6名“严重”COVID-19患者的 51631个细胞)。以及Lambrechts等人绘制的7个正常肺样本( 64,876个细胞)和Reyfman等人绘制的8个正常肺样本(27,266个细胞)。本文生成了包括5例COVID-19轻症患者和26例重症患者与10例轻症患者和3例重症非COVID-19患者进行比较的数据。结果发现单核细胞和中性粒细胞在COVID-19患者中比非COVID-19患者更常见，特别在危重患者中更突出，巨噬细胞和上皮细胞也表现相似的情况。相反，CD8+ T细胞和NK细胞在轻度疾病中轻度富集。当比较轻度和重度COVID-19时，发现前者的CD8+ T细胞、巨噬细胞和cDC增加。

图 1 COVID-19和非COVID-19 中BAL的细胞类型

2.CD8+ T细胞在COVID-19 BAL中的表型异质性

对T细胞单独进行聚类分析，得到23,468个T-和NK细胞，分为14种表型，包括7个CD8+ T细胞簇，5个CD4+ T细胞簇和2个NK细胞簇。此外，耗竭样T细胞（TEX）还发现了基于ZNF683和ITGAE的CD8+驻留记忆T细胞(TRM)，以及CD8+近期激活效应记忆T细胞(TEMRA）。本文评估了每种T细胞表型在COVID-19与非COVID-19疾病中的患病率，但未能观察到CD8+T细胞表型的差异，当比较轻度和重度COVID-19(图2e)时，在COVID-19的轻度和危重型中，CD8+ TRM细胞的增幅最大。

图 2 轻度和危重型COVID-19 中BAL的T细胞表型

使用Slingshot来推断CD8+T细胞的时间轨迹，观察到以TRM、TEX 和TEMRA 3种不同的轨迹，同时反映出每种表型状态下T细胞相对数量的密度(图3d)。并对正常组织、非COVID-19、轻度或严重COVID-19进行分层，非COVID-19 T细胞在TRM细胞系接近尾声时富集，而在COVID-19中TEX细胞富集(图3e)。通过scTCR-seq分析T细胞，获得了3966个T细胞，其TCR序列也由scRNA-seq注释(不包括NK-， TMAIT-和Tγδ-细胞)。CD8+ TRM细胞含有最多的T细胞克隆型。特别是在COVID-19(图3h)，可能表明抗原驱动的克隆扩增。这种扩增在轻度COVID-19中更为显著(图3i)。这表明轻度COVID-19的特征是TRM细胞在轨迹的末端进行活跃的(可能是抗原驱动的)TCR扩增。

图 3 轻度和危重型COVID-19 BAL中的CD8+ T细胞表型

3. COVID-19患者中BAL 的CD4+ T细胞的表型异质性

鉴定出幼稚CD4+ T细胞、效应记忆T细胞(TEM）、CD4+ T-helper-1-like (TH1-like)细胞、CD4+调节性T细胞。与非COVID-19相比，观察到COVID-19患者的CD4+ TH17细胞略少，但TH1样细胞更多。比较轻度和重度COVID-19，发现后者的TH1样细胞显著增加(图2d, e)。

使用Slingshot来推断CD4+T细胞的时间轨迹，观察到分别形成TH1-like、TH17-和TSCM细胞3种不同的轨迹。结果表明来自轻度COVID-19的CD4+ T细胞表现与正常肺或非COVID-19 BAL类似(图4f-g)。COVID-19的TH1样细胞系中TCR的丰度和均匀度均降低，而非COVID-19的TH1样细胞系中TCR的丰度和均匀度均降低(图4h)。同时这种减少在关键的COVID-19病例中最为显著(图4i)。相比之下，TH17细胞和TSCM细胞的特征是仅在其运动轨迹的末端TCR丰度略有下降，这表明主要是TH1样细胞被特异性选择为SARS-CoV-2 抗原。

图 4 轻度和严重COVID-19 BAL中CD4+ T细胞的表型和发育轨迹

4. COVID-19 BAL中单核-巨噬细胞分化的轨迹

BAL的63114个骨髓细胞中，鉴定出9种表型(图5a），单核细胞可进一步分为FCN1high、IL1Bhigh和HSPA6high(图5b），分别以经典单核细胞标记物(IL1RN, S100A8/9)、促炎细胞因子(IL1B, IL6, CCL3, CCL4)和热休克蛋白(HSPA6, HSPA1A/B)的表达为特征。COVID-19与非COVID-19相比，FCN1high和IL1Bhigh单核细胞显著增加，特别是在危重疾病中(图5c)。

在COVID-19中，FABP4medium和FABP4high肺泡巨噬细胞均减少，尽管在轻症和危重症比较中无显著差异。FCN1高单核细胞在轻度和危重型COVID-19中显著减少，而肺泡巨噬细胞增加(图5d)。

使用Slingshot重建了两个单核-巨噬细胞谱系。COVID-19细胞在两个细胞系的前半段均富集(图5g)，证实了我们在COVID-19中单核细胞富集的观察结果。

图 5 COVID-19 BAL中的单核-巨噬细胞分化轨迹

5. scRNA-seq分析COVID-19中性粒、树突细胞和B细胞

通过对14154个中性粒细胞进行分析，主要由“祖细胞”中性粒细胞和炎症性中性粒组成，其中所有中性粒细胞亚簇在COVID-19中比非COVID-19更常见，但中性粒细胞的富集与疾病严重程度、肺损伤和细菌感染无关。分析了1410个树突细胞(cDC)，并分为6个群体(图6f)。所有这些在COVID-19和非COVID-19之间均无显著差异，而移行性树突细胞和朗格汉斯细胞样树突细胞在COVID-19轻度患者中比危重患者更常见。分析了1397个B细胞，确定了4个独立的簇(图6j)。滤泡B细胞由“成熟-幼稚”(CD27-)和“记忆”(CD27+) B细胞组成。与非COVID-19相比，COVID-19中成熟幼稚B细胞和活跃的浆细胞增加(图6)。

图 6 COVID-19 BAL中的中性粒细胞、树突状细胞和B细胞表型

6. 上皮细胞和免疫细胞中的SARS-CoV-2病毒颗粒

22215个上皮细胞由分泌型、纤毛型和鳞状肺上皮细胞组成。尽管上皮细胞在COVID-19患者中较非COVID-19患者少，但基底细胞和离子细胞(一种罕见的上皮细胞类型，可调节盐平衡)在COVID-19患者中显著富集，轻度和重度COVID-19之间无显著差异。ACE2和TMPRSS2在COVID-19 表达增加，COVID-19上皮细胞表达这些基因(图7e, f)。最后与SARS-CoV-2基因组对应的测序序列比较，确定了3773个阳性细胞来自于31例COVID-19患者中的17例病人。利用病毒追踪发现了编码刺突蛋白的RNA（S），在病毒进入细胞期间与ACE2相互作用，几乎只在上皮细胞中，这也是唯一表达ACE2和 TMPRSS2的细胞(图7h, i)，表明S+上皮细胞已经被严重感染。

图 7 上皮细胞和免疫细胞中SARS-CoV-2 RNA的检测

结论

利用单细胞转录组学研究SARS-CoV-2的先天性和适应性肺部免疫应答。观察到SARS-CoV-2感染过程中免疫细胞组成、表型和免疫交叉的显著变化，并确定了COVID-19轻度和重度的几个明显的免疫特征。同时记录了几条免疫通路的基因足迹，它们与COVID-19病理和SARS-CoV-2感染生物学有关。该研究对了解COVID-19肺炎患者肺局部免疫具有重要意义，对COVID-19免疫研究、COVID-19患者免疫监测及相关治疗发展提供新的见解。

参考文献

Els Wauters1,2, Pierre Van Mo. Discriminating mild from critical COVID-19 by innate and adaptive immune single-cell profiling of bronchoalveolar lavages. J. Cell Research (2021) 0:1–19.

-THE END-