Cell research | 单细胞测序技术高逼格研究思路

2020年7月，Nature子刊Cell research发表了一篇鼻咽癌单细胞测序研究的最新成果。该研究由中山大学肿瘤防治中心，深圳华大生命科学研究院，中山大学生命科学学院与中国科学院深圳先进技术研究院强强联手，首次在单细胞水平上构建了鼻咽癌肿瘤微环境图谱，从肿瘤细胞的异质性和免疫细胞的多样性着手，挖掘了鼻咽癌预后相关分析特征和治疗靶点，为鼻咽癌的精准治疗提供了新的思路！

鼻咽癌是一种独特的头颈癌，其分布在地域上极不平衡：在东亚和东南亚特别是中国南方高度流行，也被称之为“广东瘤”。鼻咽癌的发病从病因上与EB病毒（EBV）感染高度相关，并且病理学特征表现为肿瘤病变周围和内部的免疫细胞高度浸润，该特殊的微环境特征表明免疫治疗在鼻咽癌中具有极好的应用潜力。事实上，以免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗已在鼻咽癌患者中取得了不错的临床受益。然而即使如此，鼻咽癌患者对于抗PD-1疗法的反应率也只有20%~30%，这表明我们需要加深对鼻咽癌肿瘤微环境的理解，从而探索更多有效治疗靶点，促进其精准治疗的发展。

这篇文献的研究思路可以说是单细胞研究中非常严谨，是值得学习的研究模式，下面就让我们先整体了解一下全文的脉络吧！

研究思路

临床取样：研究者取得了15名鼻咽癌患者以及1名正常人的鼻咽上皮组织以及其外周血，通过10X平台，进行单细胞测序共获得了48584个细胞，同时进行了全外显子测序和组织的转录组测序[Fig1]。

Fig1.研究设计：取样流程

研究设计：首先，将单细胞测序结果进行细胞类型注释，分为恶性细胞和免疫细胞。对恶性细胞进行肿瘤内异质性分析，对免疫细胞进行亚群识别注释。接下来，识别他们的分子特征，并且基于免疫多样性进行转录调控分析。进而构建肿瘤免疫微环境中各细胞类型间的互作网络。根据绘制出的鼻咽癌免疫全景，定位到5个恶性细胞特征基因，17个免疫特异性亚群的特征基因。最后在两套独立数据集中评估这些特征基因对临床预后和治疗意义。[Fig2]

Fig2.研究思路及流程

主要分析工具：数据基本分析：Seurat R package；

轨迹分析：Monocle 2 ；

转录调控分析：pySCENIC package；

细胞互作分析：CellPhoneDB；

主要结论

1.鼻咽癌免疫微环境的单细胞表达图谱及细胞类型注释

通过已有文献得到的各种细胞类型的marker进行染色，将细胞分为上皮细胞（恶性和非恶性），免疫细胞（如髓系细胞，T/NK细胞，B细胞），肿瘤相关成纤维细胞。进而，从上皮细胞中推断CNVs,最终鉴别到了7561个恶性细胞。对各类细胞进行进一步细分，最终识别出13个恶性细胞亚群和23个免疫细胞亚群，绘制出了首个鼻咽癌单细胞图谱。有趣的是，作者还发现与肿瘤上皮细胞巢相比，免疫细胞在肿瘤基质中更多富集，特别是对于CD20 + B细胞，CD57 + NK细胞和IL3RA +浆细胞样树突状细胞（pDC）。值得注意的是，肿瘤上皮细胞巢中CD8 + T细胞的浸润相对高于其他免疫细胞类型，表明肿瘤内不同免疫细胞亚型的空间异质性。[Fig3]

Fig3. 鼻咽癌免疫微环境的单细胞表达图谱及细胞类型注释

2.恶性细胞瘤内转录异质性特征识别

恶性细胞的聚类分群显示出肿瘤间异质性。在不同样本肿瘤间的差异基因反映了肿瘤样本间的表型多样性，并发现了44个在不同肿瘤细胞亚群中均表达的元基因，进行相关基因表达分析后可以分为5个恶性基因表达特征。三个上皮分化相关特征主要由上皮基因组成，例如细胞角蛋白（例如KRT6）和富含脯氨酸的蛋白（例如SPRR2和SPRR3）。第四个特征与细胞循环有关，由细胞循环相关基因组成，最后一个特征富集与细胞分泌相关的基因。这些特征被恶性细胞亚群优先但不是唯一地表达。值得注意的是，EBV阳性肿瘤中观察到的Epi-differ 2得分明显高于在EBV阴性肿瘤中的得分。与病毒进入宿主细胞高度相关，表明它们通过调节NPC中的EBV感染在促进上皮分化中发挥作用。有趣的是，瘤内TILs和细胞周期特征显著正相关，反映了肿瘤-免疫的相互作用，很可能是瘤内TILs浸润的减少阻碍了对突变肿瘤细胞的识别和破坏。而基质TILs与细胞分泌信号呈正相关，表明细胞分泌信号的高表达可能促进了NPC中淋巴细胞向TME的募集。[Fig4]

Fig4. 恶性细胞瘤内转录异质性特征识别

最后，将这些找到的特征与临床资料相结合，发现细胞周期特征预测鼻咽癌中恶性细胞的侵袭性。[Fig5]

Fig5. 细胞周期特征预测鼻咽癌生存

3.NR1H3和TFEC促进单核细胞衍生的巨噬细胞的分化和成熟并与NPC患者预后改善之间存在关联

作者将髓系细胞分为了6个亚群，DC1表达了许多传统1型DCs (cDC1)的经典标记，包括CLEC9A、IRF8和IDO1。交叉启动抗肿瘤CD8+ T细胞的关键DC亚型，在抗肿瘤免疫中起关键作用；DC2优先表达了传统2型DCs (cDC2)的经典标记基因，包括CD1E、FCER1A和CLEC10A；DC3表达的标记，如CCR7、LAMP3、FSCN1和CCL19，它们与DC激活相关；编码促凋亡酶颗粒酶B的GZMB在pDCs中高表达，提示该群体的细胞可能表现出GZMB依赖的细胞毒性；通过差异表达基因和富集分析，发现：参与干扰素（IFN）-α和IFN-γ反应的通路在巨噬细胞中上调，而血管生成，NF-κB介导的TNF-α信号传导和缺氧相关通路在单核细胞中被上调。这些结果表明，NPC中单核细胞可能具有促进肿瘤的特点，与S100A8和S100A9的高表达相一致。转录因子分析结果显示：巨噬细胞和单核细胞在许多TF上具有相似的表达模式，这表明巨噬细胞可能源自募集到NPC TME的单核细胞。BACH1和RUNX1调控的基因的表达在单核细胞中特异性表达，而NR1H3和TFEC的表达在巨噬细胞中很明显。[Fig6]

Fig6.NR1H3和TFEC促进单核细胞衍生的巨噬细胞的分化和成熟

4.T/NK细胞表型提示鼻咽癌中有调节抗肿瘤免疫反应的调节因子

同样的分析步骤在T/NK细胞中进行，在这里，有趣的是，T细胞中耗竭性的标记基因LAG3和HAVCR2与细胞毒性标记物的表达高度相关，LAG-3 +和HAVCR2 + CD8 + T在细胞瘤内显著高表达，且代表好的生存。这可能是潜在的免疫治疗检查点！转录调控分析发现，NFATC1可调控T细胞活化后PD-1的表达，这与CD4+ tconv3中PD-1的表达上调一致，提示NFATC1可能是CD4+ Tconv细胞功能障碍的调控因子。NK细胞与具有细胞毒性CD8 + T细胞的部分TF（例如EOMES，RUNX3和XBP1）均上调。[Fig7]

Fig7. T/NK细胞表型提示鼻咽癌中有调节抗肿瘤免疫反应的调节因子

5.鼻咽癌微环境存在复杂的细胞互作关系

最后，作者对各种细胞类型的互作能力进行了解析，总体来说，肿瘤细胞和免疫细胞之间有较强的互作能力（图6a,b）。肿瘤细胞表达较高水平的趋化因子(如CCL20、CCL19和CXCL10)，而相应的受体在免疫细胞中广泛表达，提示这些趋化因子在增强免疫细胞浸润鼻咽癌组织中发挥重要作用。在巨噬细胞，DC1，DC2和DC3中，尤其是在巨噬细胞和DC3中，检测到趋化因子高表达，表明它们在募集各种类型的免疫细胞中起重要作用。有趣的是，DC3和T细胞之间的抑制性通讯也很普遍，最近的研究表明这种DC表型是淋巴细胞最活跃的免疫调节因子。DC1表达了相对高水平的XCR1，而XCR1配体(XCL1和XCL2)在NK细胞中过表达，表明NK细胞和DC1之间存在功能相互作用，可能NK细胞介导DC1进入鼻咽癌TME。[Fig8]

Fig8. 鼻咽癌微环境存在复杂的细胞互作关系

6.免疫细胞特征与临床预后密切相关

作者将以上在免疫细胞中发现的特异性亚群与临床资料进行关联分析，发现5种免疫细胞（即pDC，DC1，NK细胞以及FCRL4 +和血浆B细胞）与EBV感染相关，与EBV阴性肿瘤相比，所有这些免疫特征在EBV阳性肿瘤中的得分均显着降低。CLEC9A + DC1与EBV DNA水平呈显着负相关，表明DC1可能受EBV主动复制的影响(图7a,b)。DC1，FCRL4 + B，GC B和浆细胞与较高数量的突变显着相关，但是大多数免疫细胞亚型通常与突变负荷相关性较弱。生存分析结果显示，生存率与巨噬细胞，pDC，DC1，NK细胞和浆细胞的特征之间存在显著的正相关。提示这些特征可作为鼻咽癌的潜在预后标志物! [图9]

Fig9. 免疫细胞特征与临床预后密切相关

小编总结：这篇文献首次绘制了鼻咽癌单细胞图谱，发现了多个新的潜在预后标志物，对其精准治疗意义重大。更重要的是，这篇文章也为我们通过单细胞研究肿瘤微环境提供了一个很好的范本，有兴趣的小伙伴可以通过下面的链接去仔细研读该文献，希望能为大家的科研之路提供一些方向！

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41422-020-0374-x