8+！单细胞+m6A相关分析~

导语

N6-甲基腺苷 (m6A) RNA 甲基化在各种癌症的关键遗传事件中起关键作用；然而，m6A 如何在肿瘤微环境 (TME) 中发挥作用仍有待阐明。

背景介绍

单细胞数据分析在近几年一直是个热点，今天小编为大家带来的这篇文章，作者通过非负矩阵分解 (NMF) 分析了来自 33 个 CRC 肿瘤样本的单细胞 RNA-seq 数据的总共 65,362 个单细胞，用于 23 个 m6A RNA 甲基化调节因子，揭示了 m6A 甲基化介导的肿瘤微环境的细胞间通讯在调节肿瘤生长和抗肿瘤免疫调节过程中的作用。文章发表在《Journal of Translational Medicine》上，影响因子为8.44，文章题目为：Single-cell N6-methyladenosine regulator patterns guide intercellular communication of tumor microenvironment that contribute to colorectal cancer progression and immunotherapy。

数据介绍

本研究从SMC 数据集中收集了 23 名 CRC 患者的65,362 个 scRNA-seq 数据集的基因表达和表型矩阵。从 TCGA 和 GEO 数据库中获得了 11 个公共数据集，其中包含 2653 名 CRC 患者的大量 mRNA 数据。

技术路线

本文技术路线如图所示。

结果解析

01

CRC TME细胞中m6A调控因子的landscape

m6A RNA 甲基化调节因子的 landscape 如图 1A 所示。SMC 数据集包含来自 23 名 CRC 患者的 33 个样本中的 65,362 个 TME 细胞，这些细胞标注了主要细胞类型，包括上皮细胞、肥大细胞、骨髓细胞、基质细胞、T 细胞和 B 细胞（图 1B）。细胞通讯分析显示这些细胞类型之间存在多种不同的相互作用（图 1C）。然后本研究通过利用Seurat的AverageExpression函数充分评估了m6A调控因子的平均RNA表达与CRC样本的常见变量之间的显著差异，例如类别类型（正常与肿瘤）、MSI 状态（MSI-H与 MSS）、年龄组（老年人 > 60 与年轻人 < = 60）、AJCC 阶段和性别（图 1D）。结果显示来自 SMC 数据集的 CRC 中六种细胞类型的 m6A 调节因子的表达确实不同（图 1E）。

图 1

最后，本研究通过分别使用 scRNA 数据中 23 个 m6A 调节因子的表达，显示了感兴趣的四种细胞类型（成纤维细胞、巨噬细胞、T 细胞和 B 细胞）的 m6A 特殊 NMF 簇的比例，结果如图1F所示。

02

新型m6A介导的成纤维细胞参与了CRC的TME

CRC数据集中的基质细胞可以在CRC的肿瘤和正常组织中分为成纤维细胞和非成纤维细胞。伪时间分析显示，m6A RNA 调节因子在包括成纤维细胞、NK 细胞、巨噬细胞、CD4 + T 细胞和 CD8 + T 细胞等在内的 TME 细胞的轨迹过程中发挥着关键作用（图 2A)。通过细胞通讯分析，本研究发现在这些与m6A相关的成纤维细胞簇(命名为 HNRNPA2B1 + CAF-C1 (n = 1939)，WTAP + CAF-C2 (n = 245) )、HNRNPC + CAF-C3 (n = 1194) 和 NoneMethy-CAF-C4 (n = 84))和上皮细胞之间存在不同数量的配体受体连接(图2B)。其中，WTAP + CAF-C2人群在肿瘤样本中的比例)高于正常样本(图2C)。KEGG富集分析结果如图2D所示，WTAP + CAF-C2细胞簇富集到IL-17活性、TNF信号传导和基于DEGs的中性粒细胞相关功能。本研究还计算了源自先前研究的Pan-CAF特征，发现WTAP + CAF- C2评分与炎性CAF (paniCAF)密切相关(图2E)。

图 2

接下来，本研究通过基因调控网络分析发现 26 个 TFs 的表达在四个簇之间存在显著差异，REL、CEBPB、FOSL1、POU2F2、NFKB1、IRF1 和 ETS1 的 TF 在 WTAP + CAF-C2 簇中上调（图 2F）。从通路热图（图 2G）中可以看出， WTAP + CAFC2 和 NoneMethy-CAF-C4 的通路基因表达显著不同，富集图显示 HNRNPA2B1 + CAF-C1、WTAP + CAF-C2 和 NoneMethy-CAF-C4 具有不同的 REACTOME 通路特征（图 2H）。

03

m6A介导的巨噬细胞分析

本研究从骨髓细胞中提取了总共 5822 个巨噬细胞，并分为肿瘤相关巨噬细胞（5586 个细胞）和正常巨噬细胞（236 个），获得了五个主要的 m6A-mac 集群，包括四个具有 m6A 调节器表达的集群（WTAP + mac-C1，n = 1432；HNRNPC + mac-C2，n = 1538 ; HNRNPA2B1 + mac-C3, n = 2169; YTHDC1 & YTHDF3 + mac-C4, n = 442) 和一个不表达 m6A 调节剂的簇 (NoneMethy-mac-C5, n = 241) (图 3A)。 接下来，本研究使用 Seurat 的 AddModulScore 函数对 TAM 中的这些特征进行分析，结果发现 WTAP + mac-C1 与促炎巨噬细胞显著相关，而 HNRNPA2B1 + mac-C3 与 SPP1 + 和 C1q + 巨噬细胞显著相关（图 3B、C）。此外，巨噬细胞的 SCENIC 分析显示 WTAP + mac-C1 和 HNRNPA2B1 + mac-C3 簇之间潜在的 TF 激活不同（图 3D）。

图 3

为了评估m6A-mac簇和特殊通路之间的关系，本研究使用GSVA检测到113个代谢通路中的41个在5个m6A-mac簇之间有显著差异(图3E)。富集图还显示，WTAP + mac-C1、HNRNPA2B1 + mac-C3和TTHDC1&YTHDF3 + mac-C4具有不同的REACTOME通路特征(图3F)。

04

m6A介导的T/B细胞表型强调了CRC中的抗肿瘤免疫反应

在检测到的 23,115 个 T 细胞中，本研究确定了 8 种主要细胞类型，包括 CD4+、CD8+、Treg、NK等，以进行进一步分析（图 4A）。NMF算法识别出总共5个m6A相关细胞簇，命名为methy-T-C1至methy-T-C5（图4B），这些m6A相关T细胞簇与肿瘤上皮细胞之间的配体-受体连接数量不同（图4C）。网络调控分析显示，在这些m6A T细胞簇中，TFs的表达存在显著差异(图4D)。此外，为了评估 m6A 相关 T 集群对 T 细胞的整体影响，本研究发现共刺激、共抑制和一些功能相关标志物的免疫基因的平均表达存在许多差异，还发现这些 m6A 簇 CD4 + T、CD8 + T、Treg 和 NK T 细胞的平均特征表达存在许多差异，包括 T 耗竭评分、T 细胞毒性评分、T 效应器评分和 T 逃避评分（图4E)。对于 9146个 B 细胞，NMF m6A 簇与上皮细胞具有相似的配体受体连接。在 m6A 相关 B 细胞组与 IgG + 浆 B 细胞、IgA + 浆 B 细胞和 CD19 + CD20 + B 细胞之间没有发现显著相关关系（图 4F-H），然而，热图揭示了 m6A 簇之间显著不同的 TF（图 4I）。

图 4

05

m6A介导的TME模式有助于CRC的预后和免疫治疗

为了获得主要 CRC TME 细胞类型的特征，本研究重新计算了它们在 CRC scRNA 数据中的 DEG，并提取了前 30 个作为细胞标记。然后，根据 m6A 介导的 TME 细胞的所有 DEG，本研究使用 GSVA 计算 m6A 子评分，并通过对来自8个和11个CRC队列的1892和2315例CRC患者的OS和RFS进行meta分析，探讨它们在CRC患者和泛癌中的预后，结果分别见图5。

图 5

接下来本研究将所有评分分为两组进行cox回归分析。随着特殊 m6A 介导的亚细胞类型中主要主导 m6A 基因的变化，本研究发现在这些亚细胞群(包括CAF、巨噬细胞、CD8 + T、Treg和B细胞)中，它们的无复发生存率(图5A)和总生存率(图5B)显著不同。此外，本研究使用logistic回归方法观察了m6A亚TME细胞在13个公共癌症队列(包括透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、met-黑色素瘤、黑色素瘤、尿路上皮癌和膀胱癌)中接受免疫治疗的患者的免疫应答的相同有意义的现象（图 5C）。

06

m6A介导的TME模式增强了细胞间通讯

通过细胞通讯分析，本研究列出了所有配体-受体对的细胞间通讯，包括 MIF - (CD74 + CXCR4)、MIF - (CD74 + CD44)、MDK-NCL、LGALS9 - CD45、CLEC2D - KLRB1、CLEC2C - KLRB1 、 CLEC2B - KLRB1、APP - CD74、CD99 - CD99 和 ADGRE5 - CD55，存在于 m6A 亚簇到肿瘤上皮细胞肿（图 6A ）。在此，它们之间的潜在机制假设如图 6B 所示。每个 m6A 亚型可能具有不同的强度和与肿瘤上皮簇的配体受体配对，这表明 m6A 介导的 TME 细胞可能与肿瘤细胞有更多的相互作用，从而有助于 CRC 的进展。

图 6

小编总结

本研究首次通过单细胞测序分析方法，鉴定了TME细胞特异性RNA m6A修饰的细胞亚型，揭示了m6A甲基化介导的肿瘤微环境细胞间通讯在调控肿瘤生长和抗肿瘤免疫调节过程中的作用。而分析的主要局限性是scRNA-seq深度低，样本不足，研究结论需要在更多的患者中进行验证。本研究内容十分充实，研究角度十分全面，值得大家学习！