一行命令将count转为CPM/TPM/FPKM
一行命令将count转为CPM/TPM/FPKM 的软件为rnanorm,是一个基于Python开发的命令行工具。安装可以通过命令安装：
pip install rnanorm
我以featureCounts的输出文件进行举例，用featureCounts对进行基因count计数
featureCounts -T 10 -t exon -g gene_id -Q 10 --primary -p \
-a gencode.vM25.annotation.gtf -F GTF -o sample.count \
mapping/*.fil.bam
得到的gene count在sample.count文件里
# tail -n +2 sample.count 是排除第一行
$ tail -n +2 sample.count | sed '1s/Geneid/FEATURE_ID/g' | cut -f 1,7- > sample.count.tsv
$ head sample.count.tsv
FEATURE_ID mapping/RNA.fb.e11.5.rep1.fil.bam mapping/RNA.fb.e11.5.rep2.fil.bam mapping/RNA.fb.e16.5.rep1.fil.bam mapping/RNA.fb.e16.5.rep2.fil.bam
ENSMUSG00000102693.1 1 0 0 0
ENSMUSG00000064842.1 1 0 0 0
ENSMUSG00000051951.5 6 11 16 16
ENSMUSG00000102851.1 2 0 0 0
ENSMUSG00000103377.1 1 2 3 0
ENSMUSG00000104017.1 1 1 0 0
ENSMUSG00000103025.1 0 3 2 2
ENSMUSG00000089699.1 0 0 0 0
ENSMUSG00000103201.1 0 1 2 1
用cut将基因ID一列，和count数值的列提取出来。用sed将Geneid换成FEATURE_ID，因为当前版本rnanorm（ 1.5.1）要求第一列的基因ID列名必须为FEATURE_ID
然后就是一行代码将count转为CPM/TPM/FPKM。
rnanorm sample.count.tsv --annotation gencode.vM25.annotation.gtf \
--cpm-output sample.count.cpm.tsv
--tpm-output sample.count.tpm.tsv \
--fpkm-output sample.count.fpkm.tsv \
- 位置参数为基因count文件
- --annotation 基因组注释GTF文件
- --cpm-output CPM输出文件
- --tpm-output TPM输出文件
- --fpkm-output FPKM输出文件
后面的前面
RNA-Seq测序得到的fastq数据比对至参考基因组，得到SAM/BAM文件，然后进行read count计数，得到基因表达信息。然而由于不同基因长度不同，基因长，自然容易获得更read count；不同批次数据测序量不同，数据测序量多，自然read count就会高了。所以不同基因表达量不能直接进行比较，需要进行标准化。
要对基因长度进行矫正，就除以基因长度:
- 1000bp长度基因A count=1000, 矫正后1000/1000=1
- 5000bp长度的基因B count=5000, 矫正后5000/5000=1
要对测序深度进行矫正，就除以总测序量:
- 总read count=100000, 基因A read count 1000, 矫正后1000/100000
- 总read count=200000, 基因B read count 2000, 矫正后2000/200000
CPM
CPM (count per million),对测序深度做了一个矫正。
CPM = (gene_read_count / total_count ) * 10^6
至于为啥乘一个million（10^6），我猜大概是因为gene_read_count / total_count数值太小了，不方便人查看，又英文中计数单位有个，十，百，千，百万，十亿。十亿（billion）较大了， 千(thousand)又太小了， million这个数量级刚好差不多，就乘这么个数值，在百万层级看基因表达量。
RPKM
RPKM(reads per kilobase per million),对测序深度和长度做了一个矫正。用于单端测序数据。
RPKM = (gene_read_count / (total_count*gene_length) * 10^6 * 10^3
基因count除以总read count，除以gene长度。然后避免数值太小，根据测序深度大小乘10^6, 基因长度就乘以一个10^3。
FPKM
RPKM(fragments per kilobase per million) 用于双端数据，一个fragment是一对reads。故FPKM = RPKM / 2
TPM
TPM(transcript per million), 基因FPKM 占总的FPKM的比例， TPM衡量基因在样本中的相对表达量，对同一个基因不同样本，其FPKM可能相同，但相对所有基因而言，其在不同样本中可能所占比例不同。
TPM = gene_fpkm / total_fpkm * 10^6