单细胞测序—S4类、seurat、monocle（cds）对象简介

单细胞测序—S4类、seurat、monocle（cds）对象简介

1 S4类

S4类是R语言中一种更为严格和复杂的面向对象编程方式。与更简单的S3类相比，S4类提供了更高的灵活性和严格性，适用于需要明确结构的复杂数据和应用场景。

更为详细的介绍：https://www.jianshu.com/p/dd181f0698a7

1.1 S4类的主要特点

1. 严格的数据类型检查：在S4类中，每个对象的属性（称为“槽”）的类型必须明确指定。这意味着在创建对象时，R会强制检查类型是否匹配，从而减少类型相关的错误。
2. 类的定义：S4类需要通过setClass()函数来显式定义。类定义中需要明确指定类的名称、包含的槽（属性）以及各个槽的类型。
3. 方法的定义：S4类的方法是通过setMethod()函数定义的。与S3类不同，S4类的方法是基于签名（即输入参数的类型）来选择的，这使得方法的选择更加精准。
4. 构造函数：可以使用new()函数来创建S4类的对象。new()函数会根据类的定义来检查并创建对象，确保每个槽都满足类定义中的要求。
5. 继承关系：S4类支持多重继承，允许一个类继承多个父类的属性和方法。这使得S4类在复杂的数据结构建模中非常有用。

1.2 S4类的定义示例

下面是一个简单的S4类定义示例：

# 定义一个名为Person的S4类
setClass(
  Class = "Person",
  slots = list(
    name = "character",
    age = "numeric"
  )
)

# 定义一个构造方法
setMethod(
  "initialize", "Person",
  function(.Object, name, age) {
    .Object@name <- name
    .Object@age <- age
    return(.Object)
  }
)

# 创建一个Person对象
p <- new("Person", name = "John Doe", age = 30)

# 访问S4对象的槽
p@name
p@age

在这个示例中，Person类有两个槽：name（字符型）和age（数值型）。我们使用setClass()函数定义了这个类，并用new()函数创建了一个Person对象。访问S4对象的槽时，使用@符号。

2 Seurat对象

Seurat是R语言中一个流行的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析工具包，用于从数据预处理到高级分析的多个步骤。Seurat对象是Seurat包中的核心数据结构，用于存储和管理scRNA-seq数据以及与其相关的元数据和分析结果。

2.1 Seurat对象的结构

Seurat对象是一个S4类对象，专门设计用于单细胞数据的存储和操作。它可以包含多种数据类型，包括原始计数矩阵、标准化数据、PCA结果、t-SNE或UMAP嵌入、细胞分类信息等。

一个典型的Seurat对象包含以下几个主要槽（slots）：

1. assays：存储不同类型的表达矩阵，如原始计数（RNA）、标准化数据（data）、尺度数据（scale.data）等。
2. meta.data：存储细胞的元数据，如细胞类型、实验条件等。
3. active.ident：当前的细胞身份分类或标签信息。
4. reductions：存储降维分析的结果，如PCA、t-SNE、UMAP的嵌入坐标。
5. graphs：存储细胞之间的图结构，如最近邻图（KNN图）。
6. commands：记录分析过程中运行的命令和参数。
7. project.name：项目的名称标识。

2.2 创建Seurat对象

Seurat对象通常由scRNA-seq数据矩阵创建。创建过程包括数据导入、预处理和对象初始化。以下是一个典型的Seurat对象创建过程示例：

library(Seurat)

# 假设我们有一个表达矩阵 'counts_matrix'，行为基因，列为细胞
counts_matrix <- matrix(data = rpois(2000, lambda = 5), nrow = 200, ncol = 10)

# 使用表达矩阵创建一个Seurat对象
seurat_object <- CreateSeuratObject(counts = counts_matrix, project = "ExampleProject")

# 查看Seurat对象的结构
print(seurat_object)

在这个示例中，counts_matrix是一个基因表达矩阵，其中行表示基因，列表示细胞。我们使用CreateSeuratObject()函数将这个矩阵转化为一个Seurat对象。

一般用read10x()等函数直接读取文件创建，不需要自己手动创建对象。

2.3 Seurat对象的常用操作

Seurat对象提供了丰富的操作功能，以支持数据分析的不同阶段。常见的操作包括：

1. 数据归一化：seurat_object <- NormalizeData(seurat_object)
2. 寻找高变基因：seurat_object <- FindVariableFeatures(seurat_object)
3. 数据缩放：seurat_object <- ScaleData(seurat_object)
4. 主成分分析（PCA）：seurat_object <- RunPCA(seurat_object)
5. 聚类分析：seurat_object <- FindClusters(seurat_object, resolution = 0.5)
6. 降维可视化（如t-SNE或UMAP）：seurat_object <- RunTSNE(seurat_object)

2.4 seurat对象中有哪些函数可以访问内部数据

在 SeuratObject 5 版本中，一些函数和方法已更新，用于提取和操作 Seurat 对象中的细胞表型数据、特征数据和表达矩阵，基于 SeuratObject 5：

1. meta.data: 获取或设置细胞的表型数据。

提取表型数据metadata <- seurat_object@meta.data

设置表型数据seurat_object@meta.data <- new_metadata

1. FetchData(): 提取指定细胞或基因的特定数据，特别是从 meta.data 中获取特定列的数据。

提取特定列的数据data <- FetchData(seurat_object, vars = c("nFeature_RNA", "percent.mt"))

1. GetAssayData(): 获取表达数据，使用 layer 参数来指定数据类型，例如 counts（原始计数数据）或 data（归一化数据）。

获取计数矩阵count_matrix <- GetAssayData(seurat_object, layer = "counts")

获取归一化后的表达数据normalized_data <- GetAssayData(seurat_object, layer = "data")

1. Idents(): 获取或设置细胞的分类信息（通常用于提取细胞群体的身份）。

获取细胞群体的身份cell_identities <- Idents(seurat_object)

设置细胞群体的身份Idents(seurat_object) <- new_identities

1. Cells(): 获取细胞名称或筛选细胞。

提取所有细胞名称cell_names <- Cells(seurat_object)

1. Features(): 获取特征名称（如基因名称）。

提取所有特征名称feature_names <- Features(seurat_object)

1. AddMetaData(): 向 Seurat 对象中添加新的表型数据。

seurat_object <- AddMetaData(seurat_object, metadata = new_metadata, col.name = "new_metadata")

1. DefaultAssay(): 获取或设置当前 Seurat 对象的默认 Assay。

default_assay <- DefaultAssay(seurat_object)

DefaultAssay(seurat_object) <- "RNA"

1. GetDimReduction(): 提取降维结果（如 PCA、t-SNE、UMAP）的数据。 提取 t-SNE 结果 tsne_data <- GetDimReduction(seurat_object, reduction = "tsne")

其他：

1. VariableFeatures()：
2. 获取或设置高变基因的列表。variable_genes <- VariableFeatures(seurat_object) VariableFeatures(seurat_object) <- new_variable_genes
3. DimPlot()：绘制降维分析的散点图，如t-SNE或UMAP结果。DimPlot(seurat_object, reduction = "umap")
4. 访问降维结果： Embeddings()：提取降维分析的嵌入结果（如PCA、t-SNE、UMAP）umap_coords <- Embeddings(object = seurat_object, reduction = "umap")；Reductions()：获取特定的降维对象。

3 monocle(cds)对象

Monocle是一个用于单细胞转录组数据分析的R包，尤其擅长时间序列分析（如拟时分析）和细胞状态的轨迹推断。Monocle对象是Monocle包中的核心数据结构，用于存储单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据以及与其相关的元数据和分析结果。

3.1 Monocle对象的结构

Monocle对象的核心是 CellDataSet 对象，这是一个S4类对象，专门设计用于处理单细胞转录组数据。CellDataSet 对象集成了表达矩阵、样本信息、基因注释和分析结果，能够支持从数据输入到结果输出的整个分析流程。

一个典型的 CellDataSet 对象包含以下主要组件：

1. expressionData：存储基因表达数据的矩阵，行为基因，列为细胞。
2. phenoData：包含细胞的元数据信息（类似于Seurat对象中的 meta.data），如细胞类型、实验条件等。
3. featureData：存储基因的注释信息，通常包括基因的ID、名称、描述等。
4. reducedDimA/reducedDimS/reducedDimW：存储降维结果，如PCA、t-SNE、UMAP等。
5. cellOrdering：存储细胞的拟时（pseudotime）顺序。
6. dispFitInfo：存储基因表达的离散度信息，用于过滤噪声或低表达基因。

3.2 创建Monocle对象

要创建一个Monocle对象，通常需要准备三个主要的数据：基因表达矩阵、细胞元数据（phenoData）、基因注释信息（featureData）。newCellDataSet()函数用于初始化一个 CellDataSet 对象。

通常由seurat对象转换而来：

# 将counts矩阵转换为sparseMatrix  
  data <- as(as.matrix(scRNAsub@assays$RNA@counts), 'sparseMatrix')  
  
  # 将meta数据转换为AnnotatedDataFrame  
  pd <- new('AnnotatedDataFrame', data = scRNAsub@meta.data)  
  
  # 创建基因名表并转换为AnnotatedDataFrame  
  fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))  
  fd <- new('AnnotatedDataFrame', data = fData)  
  
  # 创建CellDataSet对象  
  mycds <- newCellDataSet(data,  
                          phenoData = pd,  
                          featureData = fd,  
                          expressionFamily = negbinomial.size())  

3.3 Monocle对象的常用操作

CellDataSet 对象提供了多种函数来进行数据处理和分析，如下是一些常用的操作：

1. 数据归一化：cds <- estimateSizeFactors(cds) cds <- estimateDispersions(cds)
2. 基因过滤：cds <- detectGenes(cds, min_expr = 0.1)
3. 降维分析：cds <- reduceDimension(cds, method = "DDRTree")
4. 轨迹推断：cds <- orderCells(cds)
5. 拟时分析： cds <- orderCells(cds, root_state = 1)
6. 可视化：plot_cell_trajectory(cds, color_by = "cell_type")

3.4 cds对象中有哪些函数可以访问内部数据

1. pData(): 提取样本的表型数据（phenotype data），

pheno_data <- pData(mycds)

1. fData(): 提取特征数据（feature data），即基因或其他特征的注释信息。

feature_data <- fData(mycds)

1. exprs(): 提取表达矩阵（expression data），即每个样本在每个特征上的表达量。

expression_data <- exprs(mycds)

1. phenoData(): 直接获取 phenoData 对象，这与 pData() 类似，但返回的是完整的 AnnotatedDataFrame对象。

pheno_data <- phenoData(mycds)

1. featureData(): 直接获取 featureData 对象，与 fData() 类似，返回的是 AnnotatedDataFrame 对象。

feature_data <- featureData(mycds)

1. varLabels(): 获取 phenoData 或 featureData 中的变量标签（即列名）。

labels <- varLabels(phenoData(mycds))

1. sampleNames(): 获取样本的名称。

sample_names <- sampleNames(mycds)

1. featureNames(): 获取特征的名称（如基因名）。

feature_names <- featureNames(mycds)

其他：

1. reducedDimA()：reduced_dimensions <- reducedDimA(cds) reducedDimA(cds) <- new_reduced_dimensions
2. 获取或设置降维分析后的坐标，用于拟时轨迹推断。
3. reducedDimS()：

获取或设置在 DDRTree 算法中，用于计算轨迹的降维矩阵。

reduced_dimensions_s <- reducedDimS(cds)

1. reducedDimW()： 获取或设置在 DDRTree 算法中，用于轨迹推断的权重矩阵。 reduced_dimensions_w <- reducedDimW(cds)
2. cellOrdering()： 获取细胞在轨迹中的顺序（即拟时信息）。 trajectory_order <- cellOrdering(cds)
3. pseudotime()：

获取或设置细胞的拟时值。

pseudotime_values <- pseudotime(cds)

1. state()：

获取或设置细胞的状态信息，即细胞在轨迹中的分支状态。

cell_states <- state(cds)

1. sizeFactors()： 获取或设置用于归一化的尺寸因子。 size_factors <- sizeFactors(cds)
2. dispFitInfo()：

获取基因表达的离散度信息，用于分析表达数据的分散性。

dispersion_info <- dispFitInfo(cds)

1. cellPairwiseDistances()：

获取细胞之间的成对距离，通常用于聚类分析。

pairwise_distances <- cellPairwiseDistances(cds)