CELL丨猕猴外侧缰核的单细胞空间转录组图谱与全脑连接性---华大Stereo-seq又一篇主刊文章

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https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.02.037

2025年4月3日华大生命科学研究院等团队联合攻关， 发表在Cell主刊题为：Single-cell spatial transcriptome atlas and whole-brain connectivity of the macaque claustrum的研究论文。外侧缰核通过与众多大脑区域的连接来协调大脑功能，但其分子和细胞的组织结构仍未明晰。通过对227,750个猕猴外侧缰核细胞进行单核RNA测序，识别出48种转录组定义的细胞类型，其中大多数谷氨酸能神经元与深层岛叶神经元相似。对猕猴、棕头狨猴和小鼠的转录组进行比较，揭示了猕猴特有的细胞类型。在67个皮层区域和7个皮层下区域进行逆行示踪注射，定义了四个逆行标记的外侧缰核神经元的不同分布区。通过整合全脑连接性与单细胞空间转录组分析，发现这四个区域包含不同成分的谷氨酸能（但不是GABA能）细胞类型，它们优先与特定的大脑区域连接，并且具有较强的同侧偏向性。几个猕猴特有的谷氨酸能细胞类型在腹侧与背侧外侧缰核区，选择性地共同投射到两个功能相关的区域——嗅皮质和海马对比运动皮质与壳核。这些数据为阐明支撑外侧缰核多样化功能的神经元组织结构提供了基础。

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背景介绍

外侧缰核是一个薄薄的端脑结构，位于岛叶皮层下方，几乎与所有皮层区域都有相互连接。研究认为它是一个可能整合与意识感知相关信息的区域。大量研究揭示了外侧缰核对皮层以及大脑功能的作用，如睡眠调节、显著性引导的注意力、抑郁、行为参与、认知控制和意识等。早期在猕猴中的解剖学研究提示了外侧缰核区域的大致拓扑图以及它们对应的皮层靶区。近年来，单细胞空间转录组学的进展阐明了啮齿动物和灵长类动物多个大脑区域中不同细胞类型的基因表达景观。然而，灵长类动物外侧缰核中细胞类型的空间分布及其大脑全局连接性仍然不清楚。

猕猴外侧缰核明显被外囊（ec）和极囊（exc）的白质所界定。小鼠和人类外侧缰核的单细胞转录组特征表明，部分外侧缰核细胞与皮层神经元共享标记基因。然而，猕猴大脑中外侧缰核与其他脑区之间细胞类型的整体相似性尚未被深入研究。一些猕猴研究表明，外侧缰核与亚板（或第6b层）具有相同的发育来源，但也有研究表明它源自不同的外侧大脑皮层区域。对外侧缰核与其他大脑区域之间的转录组定义细胞类型进行综合比较，有助于解决这些问题。

在这里，我们构建了猕猴外侧缰核的单细胞分辨率空间转录组图谱，采用了单核RNA测序（snRNA-seq）和时空增强分辨率组学测序（Stereo-seq）方法相结合。为了绘制外侧缰核神经元的投射模式，我们在分布于67个皮层区域和7个皮层下结构的171个部位，以及5个外侧缰核内位置进行了荧光逆行示踪注射。我们进行了空间转录组与连接性映射的联合分析，并揭示了外侧缰核中的谷氨酸能神经元类型，它们优先与功能相关的皮层和皮层下结构相连接。总之，这些结果提供了一个全面的数据库，用于研究灵长类动物大脑中支撑外侧缰核各种功能的细胞和分子组织结构。这些数据可以通过一个互动网站访问（外侧缰核数据：https://macaque.digital-brain.cn/claustrum）。

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科学问题与创新性

1.大脑区间连接的复杂性：尽管关于大脑不同区域的连接已有大量研究，但大脑皮层与其邻近的亚皮层区域的特定连接，尤其是对于claustrum（隔离核）的研究较为缺乏。此研究提出了一个基本的科学问题：claustrum作为大脑的重要区域，其细胞类型和脑全连接如何在分子水平上展现出来，尤其是在灵长类动物中。

2.细胞类型的分类和分布：尽管早期研究对claustrum的解剖区域和它与大脑其他区域的相互作用有所了解，但其细胞类型及其功能连接的精细分布仍未明确。这一研究通过单细胞RNA测序，揭示了227,750个灵长类隔离核细胞的转录组信息，识别了48种转录组定义的细胞类型，并阐明了其与大脑不同区域的连接模式。

3.单细胞空间转录组学的应用：该研究结合了单核RNA测序（snRNA-seq）和空间增强分辨率的基因组学测序技术（Stereo-seq）构建了灵长类隔离核的空间转录组图谱，这种方法的创新性在于能够在单细胞分辨率下，揭示细胞类型的分布与其空间定位的关系。

4.跨物种对比分析：该研究不仅在猕猴中进行分析，还通过比较猕猴、豆猴和小鼠的转录组，发现了猕猴特有的细胞类型。此跨物种的对比分析为了解灵长类与其他哺乳动物之间的差异提供了新的视角。

5.脑区连接的空间分析：该研究通过在67个皮层区域和7个亚皮层区域进行反向示踪剂注射，定义了四个隔离核神经元的分布区，揭示了这些区域的神经元类型和特定功能区域之间的连接模式，强调了大脑半球同侧连接的偏好。

6.细胞类型与功能相关区域的连接：特别地，研究表明猕猴特有的兴奋性神经元类型与记忆相关区域（如内嗅皮层和海马）以及运动相关区域（如运动皮层和壳核）具有特异性连接，这一发现具有重要的生物学意义，有助于进一步理解隔离核在认知和行为功能中的角色。

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猕猴外侧缰核细胞类型的转录组分类

我们对四只成年猕猴的外侧缰核细胞进行了单核RNA测序（snRNA-seq）分析，并使用无监督的统一流形逼近与投影（UMAP）聚类方法，根据基因表达谱的相似性识别了假定的细胞类型。我们还对来自两只猕猴左半球的67个外侧缰核冠状切片进行了单细胞空间转录组分析（Stereo-seq）。空间图谱中的细胞通过将它们的基因表达谱与snRNA-seq定义的细胞类型进行匹配来进行注释（图1A）。

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在质量控制（见STAR方法）后，snRNA-seq分析包含了227,750个细胞，每个细胞平均有4,664个分子标识符（MIDs）和1,884个检测到的基因。我们的UMAP分析识别出了三大细胞类别：“谷氨酸能细胞”（GLUT）：122,006个细胞；“GABA能细胞”（GABA）：34,293个细胞；“非神经元细胞”：71,451个细胞，这些细胞进一步被划分为16个子类（图1B），包括3个谷氨酸能子类（标记基因为GNB4、RGS6和ZFPM2）、8个GABA能子类（LAMP5、VIP、RELN、PVALB、SST、PDE10A、LHX6和UNC5B）以及5个非神经元子类，包括星形胶质细胞（SLC1A2）、寡胶质前体细胞（OPCs，PCDH15）、寡胶质细胞（MOBP）、小胶质细胞（C1QB）和内皮细胞（FLT1）。大多数子类包含来自四只猕猴的细胞，这验证了数据的可重复性，进一步通过随机森林分析得到了验证。这16个子类可以进一步划分为48个假定的“细胞类型”：22个谷氨酸能细胞类型、19个GABA能细胞类型和7个非神经元细胞类型（图1C）。使用“spatial-ID”方法，我们注释了两只猕猴的Stereo-seq图谱中的细胞，并将其与48个snRNA-seq定义的细胞类型进行匹配（见STAR方法）。细胞类型的分布在猕猴之间是一致的，各种细胞类型的比例与snRNA-seq分析所发现的结果相似。

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猕猴外侧缰核与相邻大脑区域细胞类型的比较

为了将外侧缰核中的snRNA-seq定义的细胞类型与岛叶、壳核和杏仁核中的细胞类型进行比较（图2A），我们对猕猴杏仁核（44,967个细胞）、岛叶（76,527个细胞）和壳核（39,439个细胞）中的细胞进行了UMAP聚类分析，并使用已知的标记基因对聚类进行注释。为了保证一致性，我们使用了来自相同两只猕猴供体的细胞，并将每个区域的细胞数下采样至大约15,000个细胞。对合并细胞的集成聚类分析显示，大多数聚类包括来自所有四个区域的细胞，尽管各区域的相对贡献不同。总体来看，外侧缰核的聚类与岛叶的聚类更为相似，而与壳核或杏仁核的聚类差异较大（图2B）。

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通过共现分析，展示了外侧缰核与三个相邻大脑区域的转录组细胞类型的重叠情况，通过细胞类型重叠得分的热图来可视化（图2C），结果表明，外侧缰核中的谷氨酸能细胞类型与岛叶中的细胞类型比与杏仁核中的细胞类型更为相似，而GABA能和非神经元细胞在四个大脑区域间相似性较高。平均重叠得分揭示，外侧缰核与其他三个大脑区域的相似性在不同的细胞子类之间有所不同——所有岛叶子类与外侧缰核的细胞类型相似，但只有部分杏仁核子类与外侧缰核的细胞类型相似（图2D）。进一步通过重新注释外侧缰核细胞为岛叶标注来比较谷氨酸能细胞类型（图2E）。GLUT/GNB4子类主要重新注释为L5/6层内侧皮层（IT）Car3岛叶细胞，少数细胞被标注为L2/3层IT细胞。几乎一半的GLUT/RGS6子类与L5 IT和L6 IT岛叶细胞匹配，而几乎所有GLUT/ZFPM2子类与L6皮质丘脑（CT）和L6b岛叶细胞匹配。有趣的是，外侧缰核中的绝大多数（86.4%）谷氨酸能细胞与深层（L5/6层）岛叶细胞相似，支持外侧缰核与岛叶之间的发育关系。

进一步对外侧缰核与7个皮层区域的重叠得分进行检查（已发表数据）显示，外侧缰核的谷氨酸能子类在所有这些皮层区域中都有出现。然而，外侧缰核中的GNB4 GLUT子类与岛叶中的细胞更为相似，而与其他皮层区域的细胞差异较大。此外，谷氨酸能和GABA能子类在外侧缰核与岛叶之间的基因表达谱具有最高的相关性。有趣的是，表达神经肽Y（NPY）的GABA/SST细胞的比例——这些细胞是已知的长程投射GABA能神经元——在外侧缰核中明显高于所有皮层区域（图2F），这表明外侧缰核有更强的抑制性输出。

最后，我们对大脑皮层区域之外的6个皮层区域以及包括外侧缰核、杏仁核、壳核、尾状核、外侧苍白球（GPe）、内侧苍白球（GPi）、伏隔核（NA）、内侧膝状体及Meynert基底核（SI/NBM）和海马等多样的皮层下区域的神经元多样性进行了表征。总体来说，外侧缰核中的细胞与皮层神经元的相似性高于与皮层下神经元的相似性（图2G）。

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跨物种比较外侧缰核基因表达与细胞类型组成

对猕猴、豆猴和小鼠外侧缰核的单独UMAP聚类分析分别识别出了猕猴中48种细胞类型、豆猴中39种细胞类型（109,093个细胞）以及小鼠中60种细胞类型（234,986个细胞）。进一步对三种物种合并细胞进行UMAP聚类分析，使用猕猴的亚类注释对豆猴和小鼠的细胞进行注释。结果显示，不同物种之间单个亚类的相对丰度有所不同。对于谷氨酸能神经元，GNB4子类在猕猴和豆猴中占主导地位，但在小鼠中仅占少数（14.7%）（图2H），而ZFPM2子类在小鼠中更为丰富。对于GABA能子类，LAMP5/LHX6和VIP在猕猴中最为常见，在豆猴中较少，在小鼠中最少（图2H）。对所有16个外侧缰核亚类标记基因的跨物种比较显示了大量物种特有的标记基因——2,551个仅在单一物种中表达，912个基因在两种物种中共享，518个基因在三种物种中都有表达。这一发现与之前报道的各种皮层细胞类型的跨物种基因表达变异一致 。

我们对LAMP5/LHX6 GABA能子类进行了UMAP聚类分析，并识别出了四种不同的细胞类型，每种细胞类型都由特定基因的表达所定义。ADARB2基因是来自尾部神经节膨出（CGE）细胞的标记基因 。在LAMP5/LHX6/ADARB2+/3（主要存在于小鼠中）和LAMP5/LHX6/ADARB2+/2（在灵长类动物中扩展）细胞中表达ADARB2，支持它们源自CGE。与此相对，灵长类特有的LAMP5/LHX6/ADARB2−/1和LAMP5/LHX6/ADARB2−/4细胞几乎不表达ADARB2，表明它们源自内侧神经节膨出（MGE）。这些发现与之前的研究一致 并表明灵长类特有的LAMP5/LHX6细胞类型可能源自MGE。

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猕猴外侧缰核边界的划定

猕猴的外侧缰核由外囊（ec）和极囊（exc）所界定（图2A）。与之前的研究一致 , 我们发现许多外侧缰核标记基因（如SYNPR、NR4A2和NTNG2）能够将外侧缰核与周围结构区分开来（图3A）。此外，我们的全基因组空间转录组图谱揭示了一个清晰的边界，划定了与外侧缰核本体基因表达差异显著的区域，这一区域被定义为“边界区，位于腹内侧外侧缰核”（RBC）（图3B）。RBC区域高表达CPLX3、CABP7和SULF1，但不表达上述提到的外侧缰核标记基因（图3A，S4A个别基因，S4B重复数据和S4C Allen原位杂交（ISH）数据）。RBC区域在外侧缰核的中段最为显著。在更前面的部分，扩展的RBC将外侧缰核与背侧内嗅核（DEn）分开，DEn也高度表达传统的外侧缰核标记基因SYNPY、NR4A2和NTNG2（图3A）。

我们进一步识别了在外侧缰核、RBC和DEn中高度表达的基因，并将它们的表达水平与岛叶、壳核、杏仁核和白质（“exc”和“ec”）中的基因表达水平进行比较（图3C）。整体上，RBC的基因表达模式与外侧缰核有显著不同，而DEn中大多数高表达的基因在外侧缰核中也有较高的表达（图3C）。我们进一步识别出了一组在外侧缰核中高表达但在DEn中不表达的基因，如LXN、SMYD1、GAL和TFAP2D。尽管在DEn中，TTN和SLC17A8的整体Z分数明显高于外侧缰核，但进一步检查发现这些基因在外侧缰核腹侧部分的表达水平相当。值得注意的是，许多RBC富集的基因，如CPLX3、CTGF、SULF1和NNAT，以前被确定为小鼠外侧缰核皮质L6b或“壳层”区域的标记基因 。因此，我们认为RBC类似于小鼠的“外侧缰核壳层”或“亚板”，但它并不是猕猴外侧缰核的一部分。

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猕猴外侧缰核中细胞类型的空间组织

在每个Stereo-seq切片中，沿着背腹轴和内外侧轴对各种细胞类型的分布进行了定量分析（图3D；STAR方法），并根据分布模式将其表征为均匀分布，或表现出内外侧偏好，或背腹偏好，或两者都有。如图3E所示，大多数谷氨酸能细胞类型的分布是不均匀的，而几乎所有（16/17）GABA能细胞类型的分布是均匀的。对于非神经元细胞类型，寡胶质细胞和星形胶质细胞（星形胶质细胞/1）表现出优先分布，而寡胶质前体细胞（OPCs）、小胶质细胞和内皮细胞则均匀分布。图3F展示了四个示例谷氨酸能细胞类型在背腹和内外侧轴上的分布一致性。来自重复猴子切片的数据也显示了类似的结果。因此，外侧缰核中各种谷氨酸能细胞类型的空间组织结构高度有序，暗示它们与不同大脑区域之间存在着不同的输入和输出连接（见下文），而GABA能细胞类型的均匀分布则暗示了局部电路由中介神经元调控的均匀性。观察到的寡胶质细胞的偏向性定位可能反映了外侧缰核内白质分布的异质性。

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外侧缰核投射神经元的靶区依赖性分布

为了研究外侧缰核向不同皮层区域投射的细胞的空间组织，我们在156个广泛分布的部位注射逆行示踪剂（FastBlue或Diamedino Yellow，蓝色；霍乱毒素B亚单位（CTB）与Alexa 555结合（CTB555），黄色；CTB488，绿色；CTB647，红色），并覆盖67个皮层区域，如皮层平面图所示（图4A；STAR方法）。RBC与外侧缰核的边界通过免疫组织化学标记RBC标记物水晶蛋白mu（Crym）和对外侧缰核腹侧标记基因TTN及RBC标记基因CPLX3的RNAscope分析进行确定。我们将注射标记的神经元在同侧外侧缰核中的位置进行了映射，选择了4个皮层注射例子（图4B）。我们进一步通过基于每次皮层注射标记神经元分布的核密度估计方法，定义了逆行标记的外侧缰核神经元“分布区”（DZ）。

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我们对所有67个皮层注射区域的DZ进行了层次聚类分析，每个区域选择了一个典型的注射位置。这揭示了4个DZ聚类，反映了投射到四个不同皮层区域聚类的外侧缰核神经元分布（图4C）。图4B中示例的四个标记神经元分布对应于这四个聚类。通过对由所有156个皮层注射标记的DZ进行更细致的聚类分析，我们也发现了类似的四个聚类。然后，我们将属于同一聚类的所有标记细胞合并，定义了四个总体的“投射选择性区域”（PSZ），这些区域在图4D中以不同颜色表示。四个PSZ的合并图显示，这些PSZ在空间上是分离的，除了PSZ1部分与其他三个PSZ重叠（图4E）。

将标记外侧缰核神经元的注射部位按四种不同颜色绘制（图4A）显示，PSZ1中的神经元主要投射到前额叶、联结皮层和边缘皮层，而PSZ2中的神经元主要投射到早期视觉区域（V1、V2和V4）。高度局部化的PSZ3神经元投射到嗅内皮层（ENTO）、眶前内皮层（OPRO）、颞极（POLE）和前上颞多感觉区域（STPr）。PSZ4中的神经元主要投射到额叶运动区域和顶叶感觉区域。值得注意的是，这四个PSZ中的神经元投射到四个相对紧凑的皮层区域群，这些区域在大脑皮层平面图上大多是分隔的，且大致对应于视觉系统的不同层级（图4A）。因此，PSZ3和PSZ2的外侧缰核神经元分别投射到视觉系统中的高层级和低层级皮层区域（图4F）。

进一步映射标记神经元在对侧外侧缰核中的分布，涵盖了63个皮层部位，显示大多数（50/63）皮层区域接受双侧外侧缰核投射（图4G和4H），尽管来自对侧外侧缰核神经元的投射强度（由标记神经元的比例（FLN）定义；STAR方法）通常比来自同侧外侧缰核神经元的投射强度要弱（图4H）。

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我们还在七个皮层下结构的15个部位注射了逆行示踪剂，并发现丘脑、壳核、尾状核、海马和杏仁核的注射产生了显著数量的标记外侧缰核神经元，这些神经元在外侧缰核中具有明显的、与注射部位相关的分布模式（图4I）。进一步检查每个皮层下注射的标记细胞在四个PSZ中的比例显示，皮层下投射神经元的分布与皮层投射神经元的分布相关。例如，壳核投射的外侧缰核神经元主要位于PSZ4，该区域包含主要投射到运动皮层区域的神经元。海马投射的神经元基本上定位于PSZ3，该区域也包含投射到ENTO皮层的神经元（图4J）。因此，单个PSZ包含投射到具有相关脑功能的皮层和皮层下结构的神经元，如运动控制和记忆处理。

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皮层和皮层下区域向猕猴外侧缰核的投射

为了绘制来自不同皮层和皮层下区域的输入投射到外侧缰核，我们在外侧缰核的五个不同部位（C1–C5）注射了逆行示踪剂（图5A）。C1、C2、C3和C5注射部位的示踪剂摄取区严格局限于外侧缰核，而C4注射部位的示踪剂摄取区则包含了一些局部白质（图S5A）。对逆行标记神经元的全脑映射显示，这五个外侧缰核注射位置在皮层和皮层下区域产生了特定的标记神经元分布模式。

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来自同侧皮层的投射

对于注射部位位于同侧的皮层区域，C1注射标记的细胞主要位于前额叶、额叶运动区、边缘区和颞叶区域（图5B、5C）。C2注射标记的皮层神经元分布与C1注射的分布非常相似，唯一不同的是在更高的视觉区域标记的细胞更多。与C1和C2注射相比，C3注射在更高视觉区域标记的神经元密度明显较高，而在前额叶皮层标记的神经元较少。C4注射标记的皮层神经元数量相对较少（图S5B），它们几乎完全位于额叶运动区和顶叶感觉区（图5B和5C）。有趣的是，C4注射位于外侧缰核最背部的极端位置，这一位置包含了投射到运动皮层和躯体感觉皮层的神经元（图4A和4D）。同样，C5注射位于外侧缰核中部腹侧的位置，这一位置包含了投射到腹侧颞叶和前额叶皮层的神经元，包括嗅内皮层（ENTO）和颞极（POLE）（图4A和4D）。因此，并非所有外侧缰核注射都导致同侧前额叶皮层有大量标记神经元，与最近在小鼠中的发现不同。不同的外侧缰核区域包含接收来自和投射到不同同侧皮层区域组合的神经元。

将所有五个注射位置标记的神经元合并后，我们发现外侧缰核几乎接收来自所有同侧皮层区域的强输入，除了初级视觉皮层（V1）和区域1内的某些区域（图5D），这与之前的研究结果一致。由于外侧缰核神经元对V1和区域1有相对强的投射，这表明猕猴外侧缰核与这两个皮层区域之间的连接在很大程度上是单向的，支持外侧缰核对V1和区域1的自上而下的影响这一观点。

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来自对侧皮层的投射

对注射部位位于外侧缰核对侧的皮层区域进行标记神经元的分布映射显示，对侧皮层标记的神经元密度通常低于同侧同源区域的标记密度（图5E）。这些观察结果与啮齿动物中的发现形成鲜明对比，在啮齿动物中，对侧皮层输入到外侧缰核的强度可能比其同源同侧输入更强，尤其是运动区和扣带回区。因此，猕猴外侧缰核的皮层输入存在明显的同侧偏向。

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来自皮层下结构的投射

五个外侧缰核内注射位点导致了100个同侧皮层下核团的标记，尤其是在杏仁核和丘脑中标记较强（图5F）。C1、C2和C3注射位点标记的同侧皮层下核的分布模式与其皮层连接性有关。与C1和C2注射相比，C3注射在同侧后丘脑核团中标记了更多的细胞（图5F），特别是在丘脑后核（Puli、Pull和Pulm）、内侧膝状体（MGmc和MGpc）和外侧膝状体（LGN）中，这些皮层下结构与视觉区域及联结性顶叶皮层有广泛的连接，同时也强烈地投射到C3注射部位。

这些三个注射位点的对侧皮层下输入也表现出明显的差异。C2和C3注射位点的输入来自许多对侧皮层下结构，包括杏仁核的基外侧核、下丘脑、丘脑和脑干，而C1注射位点只接收到来自对侧下丘脑的投射。有趣的是，C4注射位点只接收来自丘脑的投射，包括腹后外侧核（VPLo，VPLc）和腹后内侧核（VPM）（图5F），这两个结构已知与躯体感觉皮层相连接，同时也向C4注射位点投射。

C5注射标记了来自多个同侧皮层下核的细胞，包括嗅觉核和海马（图5F）。与C2和C3注射类似，C5注射也标记了来自对侧杏仁核的细胞。值得注意的是，正如前文所述，C5注射位点还接收来自颞叶皮层的投射，包括嗅内皮层（ENTO），这些区域与海马和杏仁核相关的记忆功能相关。因此，个别的外侧缰核区域接收来自特定皮层下结构的输入，这些输入又部分反映了它们与皮层的连接。总的来说，我们的数据表明，猕猴外侧缰核接收来自众多皮层和皮层下结构的输入，每个外侧缰核区域接收来自功能相关的皮层和皮层下结构的特定组合的输入。

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外侧缰核内连接的背腹偏好

外侧缰核内连接在信息处理中起着重要作用，但在灵长类动物中的研究尚未深入。使用上述的外侧缰核内注射方法，我们绘制了外侧缰核各冠状切片中逆行标记神经元的分布（图5G）。我们发现，C1、C2和C3注射标记的神经元在外侧缰核的背腹轴上有类似的分布模式，且背腹方向上逐渐发生转变（图5G）。C4和C5注射标记的神经元也在背腹轴上表现出明显的偏好分布。综上所述，这些数据表明，外侧缰核内有广泛的背侧到腹侧的连接，这与在大鼠中的发现一致。

有趣的是，我们发现C1、C2和C3注射标记的神经元很少分布在背侧尾部外侧缰核和腹侧中部外侧缰核中，C4注射标记的神经元很少位于腹侧外侧缰核，C5注射标记的神经元则完全不出现在背侧外侧缰核中（图5G）。这些空间分布模式指向外侧缰核内连接的区域特异性。此外，通过确定每个注射位点标记的神经元在不同皮层PSZ中的比例，我们发现，C1–C3注射标记的外侧缰核神经元主要（>80%）位于PSZ1，而C4注射标记的神经元则几乎完全（>99%）位于PSZ4（图5H）。因此，外侧缰核内连接模式在某种程度上反映了外侧缰核的皮层PSZ，这再次暗示了猕猴外侧缰核内的不同功能模块。

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匹配转录组定义的细胞类型与投射靶区选择性神经元

我们进一步探讨了外侧缰核转录组定义的谷氨酸能细胞类型与它们的投射靶区之间的关系。我们首先确定了空间转录组图谱中的区域（图6A；STAR方法），这些区域对应于每个156个皮层注射（图4A）、9个皮层下注射和5个外侧缰核内注射位点定义的外侧缰核投射神经元的DZ。然后，计算了每个DZ中不同谷氨酸能细胞类型的密度，并进一步确定了每种细胞类型在所有DZ中的标准化密度。这使得我们能够比较不同DZ之间不同谷氨酸能细胞类型的密度差异（图6B；STAR方法）。不同细胞类型的标准化密度在四个聚类的DZ中表现出不同的模式（与图S4I中的皮层区域顺序相同）。例如，GLUT/RGS6/9细胞类型在聚类1（主要投射到前额叶、联结皮层和边缘区域）和聚类2（投射到视觉区域）的DZ中富集；GLUT/RGS6/14、GLUT/GNB4/7、GLUT/ZFPM2/15、GLUT/ZFPM2/21和GLUT/GNB4/2细胞类型在聚类3的DZ中富集（投射到ENTO、OPRO、POLE和STPr）；而GLUT/GNB4/4和GLUT/GNB4/5细胞类型则在聚类4的DZ中富集（投射到额叶运动和顶叶感觉区域）。

此外，所有四个PSZ中的谷氨酸能细胞类型的标准化密度（图6C）与聚类1–4中这些细胞类型的平均密度非常相似（图6B）。这是预期中的结果，因为不同PSZ的边界是由对应DZ聚类中投射神经元的分布定义的。不同PSZ1到PSZ4之间的细胞组成也通过snRNA-seq分析得到了验证。此外，即使是分布均匀的细胞类型，其基因表达模式也存在差异。因此，不同的PSZ表现出不同的转录组特征，这是由于谷氨酸能细胞类型的不同组成以及相同细胞类型的基因表达模式的变化。每个PSZ内的不同类型的谷氨酸能投射神经元可能对其靶向的皮层区域进行差异性调控。

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我们随后比较了皮层投射的PSZ与皮层下投射的DZ中细胞类型的组成。我们发现，ENTO投射（PSZ3）和海马投射神经元的各种神经元类型的标准化密度非常相似，运动/躯体感觉皮层投射（PSZ4）和壳核投射神经元的标准化密度也很相似（图6C）。这表明，在重叠DZ中的相同细胞类型负责靶向功能相关的大脑结构。

为了进一步研究转录组定义的谷氨酸能细胞类型是否确实优先投射到特定的皮层区域，我们将逆行示踪剂注射到ENTO皮层，并在染料注射12天后检查外侧缰核切片，以识别通过示踪剂逆行标记的空间转录组定义的细胞类型（图6D）。如预期，我们发现，逆行染料标记的细胞几乎全部位于腹侧外侧缰核的PSZ3中。所有逆行标记的谷氨酸能细胞在Stereo-seq切片中的不同谷氨酸能细胞类型的比例（在三切片中取平均）与所有附近未标记的谷氨酸能细胞在Stereo-seq切片中的比例非常匹配（图6E）。这一发现表明，PSZ3中所有细胞的细胞类型组成很好地代表了逆行标记细胞的组成，支持了几乎所有PSZ3中的谷氨酸能细胞类型都是ENTO投射的观点。类似地，我们还对初级运动皮层（图6F）、前额叶皮层和视觉区域进行了逆行示踪剂注射，再次观察到所有染料标记的谷氨酸能细胞中不同谷氨酸能细胞类型的比例与附近未标记的谷氨酸能细胞的比例相似（图6G），尽管有一些细胞类型（例如GNB4/4）显示出相对较大的差异，这表明它们的靶向存在细胞类型选择性。总的来说，这些结果表明，位于不同外侧缰核区域的转录组定义的细胞类型与不同的皮层靶向投射密切相关。

我们进一步研究了参与外侧缰核内投射的谷氨酸能细胞类型，计算了五个外侧缰核内注射的DZ中谷氨酸能细胞类型的标准化密度。我们发现，C1、C2和C3注射的谷氨酸能细胞类型分布相似，但在C1–C3、C4和C5注射之间存在明显差异（图6B，下部）。为了验证在给定的外侧缰核内注射DZ中的转录组定义的谷氨酸能细胞类型是否确实优先投射到注射部位，我们将逆行示踪剂注射到腹侧外侧缰核，并识别了逆行标记的空间转录组定义的细胞类型。我们发现，所有染料标记的谷氨酸能细胞中不同谷氨酸能细胞类型的比例与附近未标记的谷氨酸能细胞的比例相似，这表明几乎所有DZ中的谷氨酸能细胞类型都投射到注射部位。因此，不同的转录组定义的细胞类型参与了不同的外侧缰核内连接流。

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外侧缰核、RBC和岛叶之间的差异基因表达和连接性

我们进一步探索了外侧缰核和岛叶在转录组学和连接性方面的关系。我们首先将岛叶皮层的基因表达谱与外侧缰核、RBC和邻近的白质区域进行了比较，发现岛叶中显示区域富集的基因数量明显高于其他三个区域。此外，外侧缰核标记基因在岛叶L5/6层的表达水平通常高于在岛叶L2/3层的表达水平，如图S7C所示的6个代表性基因的空间表达模式。因此，外侧缰核、RBC和岛叶之间的转录组学特征差异显著。

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接下来，我们比较了猕猴外侧缰核、RBC和岛叶的连接模式。我们在67个皮层区域和6个皮层下区域进行了逆行示踪剂注射实验。我们发现，与外侧缰核神经元（投射到几乎所有皮层区域）不同，逆行标记的RBC神经元仅在少数特定的大脑区域内被标记，包括杏仁核、嗅内皮层（ENTO）、颞极（POLE）、25区、前岛叶、海马和前上颞多感觉区域（STPr）（图S7D及图S7E中的示例）。此外，对所有皮层区域（覆盖了皮层的三分之二）进行注射，均导致外侧缰核连接强度值一致较高（图S7F）。这与皮层区域之间的连接强度随距离呈指数下降的发现形成鲜明对比。此外，岛叶的投射强度通常低于外侧缰核，且变化更大（图S7F）。我们还注意到，岛叶的后部和前部的连接特征存在显著差异，前岛叶神经元仅投射到部分皮层区域（图S7F）。岛叶和外侧缰核投射到皮层下结构的连接非常相似，而RBC的投射则没有这种相似性（图S7D和S7F）。最后，不同于外侧缰核不投射到对侧外侧缰核（图S7Ga），我们发现前岛叶和后岛叶神经元都强烈投射到对侧岛叶（图S7Gb和S7Gc）。总之，我们发现岛叶、外侧缰核和RBC之间在转录组学特征和投射模式上存在明显差异。

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 技术路线图

1.单细胞转录组分析（snRNA-seq）：

对来自四只猕猴的外侧缰核细胞进行了单核RNA测序（snRNA-seq），识别了48种转录组定义的细胞类型。使用UMAP（统一流形近似和投影）聚类方法对细胞进行分类，根据基因表达特征识别不同的细胞类型。

2.空间转录组分析（Stereo-seq）：

对两只猕猴的外侧缰核左半球的67个冠状切片进行了单细胞空间转录组分析。通过空间ID对Stereo-seq数据中的细胞进行标注，将其与snRNA-seq定义的细胞类型相匹配。

3.投射模式的反向示踪：

在67个皮层和7个皮层下区域的171个位置进行了荧光逆行示踪剂注射，确定了外侧缰核神经元的四个不同分布区域（DZ）。通过空间转录组与全脑连接数据的联合分析，揭示了不同的外侧缰核区具有不同的谷氨酸能（但非GABA能）细胞类型，且这些区域偏好与特定脑区连接，存在明显的同侧偏向。

4.跨物种比较：

对猕猴、豆猴和小鼠的外侧缰核进行了单细胞转录组的跨物种比较，揭示了猕猴特有的细胞类型和基因表达模式。

5.区域边界的划定：

通过转录组分析，明确了猕猴外侧缰核与邻近区域（如DEn和RBC）之间的边界，并揭示了外侧缰核与岛叶之间的相似性。

6.空间分布模式的定量分析：

对每个Stereo-seq切片中的各种细胞类型的空间分布进行了定量分析，评估了细胞的背腹和内外侧分布特征。通过分布模式分析发现，大多数谷氨酸能细胞类型显示出非均匀分布，而几乎所有的GABA能细胞类型则均匀分布。

7.功能模块的识别：

确定了外侧缰核中的不同PSZ（投射选择性区域），这些区域的神经元分别投射到与记忆和运动相关的皮层和皮层下结构。进一步的分析揭示了猕猴外侧缰核中谷氨酸能细胞类型的选择性投射模式，强调了不同区域的功能模块。

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 文章每个结果部分总结

该研究首先使用单核RNA测序（snRNA-seq）分析了四只猕猴的外侧缰核（claustrum）细胞，并结合UMAP聚类方法，识别出了48种转录组定义的细胞类型。通过进一步的单细胞空间转录组分析（Stereo-seq），研究人员对来自两只猕猴左半球的67个冠状切片进行了研究，并将这些切片中的细胞类型与snRNA-seq数据中的细胞类型进行匹配。这一工作为理解外侧缰核的细胞异质性和其在大脑中的功能提供了关键的数据支持。

接下来，研究比较了猕猴外侧缰核与岛叶、纹状体及杏仁核的细胞类型差异。结果表明，外侧缰核与岛叶在转录组学特征上更为相似，而与纹状体或杏仁核的相似性较低。这一发现揭示了外侧缰核在大脑中的特殊地位和与岛叶的密切关系。

在跨物种比较方面，研究通过对猕猴、白面猕猴和小鼠外侧缰核的转录组数据进行聚类分析，发现猕猴具有一些特有的细胞类型。该部分的工作强调了不同物种之间在外侧缰核细胞类型和基因表达上的显著差异，进一步说明了外侧缰核在进化中的物种特异性。

关于外侧缰核的边界划定，研究表明，猕猴外侧缰核与邻近区域（如DEn）的边界可以通过转录组学分析清晰界定。研究结果还显示，外侧缰核与岛叶相比有更高的相似性，这进一步支持了外侧缰核与岛叶之间的功能性关联。

研究还进一步探讨了外侧缰核细胞类型的空间分布。分析结果表明，谷氨酸能细胞类型在外侧缰核中的分布呈现出不均匀性，而GABA能细胞则表现出均匀分布。这些结果表明，外侧缰核中不同细胞类型具有不同的功能化分布。

在投射神经元的研究中，研究人员通过逆行示踪分析，揭示了外侧缰核存在四个投射选择性区域（PSZ）。这些区域的神经元分别投射到不同的皮层和皮层下区域，且具有强烈的同侧偏向性。研究进一步表明，这些区域包含了不同的细胞组成，且各区域的细胞类型与功能密切相关。

关于皮层和亚皮层对外侧缰核的投射，研究发现来自各皮层区域的输入较为强烈，而岛叶的输入则较弱且具有较大变异。此外，研究还指出，外侧缰核的输入偏向同侧大脑皮层，这与啮齿动物的研究发现有所不同。

进一步的分析揭示了外侧缰核的内连接沿前后轴的分布偏好。这种分布模式与不同的投射区域和功能模块密切相关，尤其是不同区域的细胞类型在连接模式上存在明显差异。

最后，研究结合转录组学数据和逆行示踪数据，分析了转录组定义的谷氨酸能细胞类型与其投射靶区的关系。研究发现，外侧缰核内的不同谷氨酸能细胞类型具有选择性连接到特定的皮层区域，支持了外侧缰核在不同大脑功能区域中的作用。这一发现为外侧缰核的功能模块化提供了重要证据。

通过多种转录组学和空间定位技术的结合，研究揭示了猕猴外侧缰核在细胞类型、投射模式和连接性方面的复杂特征，为理解外侧缰核在大脑中的多重整合作用提供了重要的生物学信息。

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 文章的启发

1.细胞类型和功能模块的进一步探索：

研究揭示了外侧缰核中不同细胞类型的空间分布和投射模式，未来可以进一步探索这些细胞类型如何协调工作，形成功能模块，支持大脑的不同认知和行为功能。尤其是对于不同投射选择性区域（PSZ）的细胞组成及其功能关联，未来可以深入研究每个区域在大脑信息处理中的具体作用。

2.跨物种比较研究的深入：

本研究揭示了猕猴外侧缰核和其他物种（如豆猴、小鼠）之间的细胞类型差异，未来的研究可以进一步通过跨物种的比较分析，探索外侧缰核在不同物种中的适应性和功能差异。这不仅有助于我们理解不同物种大脑的进化，也能为神经疾病的跨物种模型提供参考。

3.探索外侧缰核的连接模式与大脑功能的关系：

外侧缰核与多个皮层和皮层下区域的连接模式为理解其在大脑功能中的角色提供了线索。未来的研究可以进一步探讨外侧缰核与其他脑区（如运动皮层、视觉皮层、记忆相关区域等）之间的连接网络，揭示外侧缰核在认知、感知和运动等多方面功能中的作用。

4.细胞类型的选择性投射与脑功能的关联：

研究发现，猕猴外侧缰核中的不同细胞类型优先连接到与记忆、运动等功能相关的脑区。未来的研究可以更深入地探讨这些细胞类型与大脑不同功能之间的关系，探索外侧缰核在特定功能模块中的调节作用。例如，可以进一步研究谷氨酸能神经元与记忆功能、运动功能的关系，揭示外侧缰核在这些功能中的作用机制。

5.应用单细胞技术与全脑连接数据：

本研究成功结合了单细胞转录组、空间转录组和全脑连接组学技术，为外侧缰核的功能研究提供了系统的框架。未来研究可以在此基础上进一步整合更多的组学数据（如蛋白质组学、代谢组学等），从多层次、多维度的角度全面解析外侧缰核的功能和机制。

6.临床应用的潜力：

外侧缰核作为一个功能复杂的脑区，其在神经疾病中的潜在作用值得关注。未来的研究可以探讨外侧缰核在精神疾病、神经退行性疾病等中的作用，尤其是如何通过调节外侧缰核的细胞类型或连接模式来改善这些疾病的症状。例如，外侧缰核可能在抑郁症、焦虑症或运动障碍中的作用为今后的临床研究提供了新的方向。

7.进一步优化与扩展空间转录组技术：

本研究采用了Stereo-seq等先进的空间转录组技术，未来可以进一步优化这些技术，提升其分辨率、覆盖范围和准确性。随着空间转录组学技术的不断发展，未来能够更精确地揭示大脑不同区域的分子特征和连接模式，进一步完善我们对大脑功能的理解。