文献分享--Castleman病的空间与单细胞图谱解析关键基质细胞类型及细胞因子通路

作者，Evil Genius

NC这种级别的文章，大佬觉得是水刊，一般课题组又高不可攀。

对于90%以上的研究者，有一篇NC真的算牛了。

今天我们分享文献

知识积累

为阐明Castleman病（CD）的细胞与分子机制，我们通过发现队列（n=9例）和验证队列（n=13例）对单中心型CD、特发性多中心型CD、HHV8相关MCD及反应性淋巴结进行了空间蛋白质组与转录组联合分析。

核心发现

基质细胞特征

CD病灶中显著增多的基质细胞形成独特微环境，活化的滤泡树突状细胞（FDC）胞质网状结构与套区B细胞的相互作用驱动B细胞活化与分化。

关键细胞亚群

• CXCL13+ FDC、PDGFRA+ T区网状细胞（TRC）及ACTA2阳性血管周网状细胞（PRC）是VEGF高表达与IL-6信号传导的主要来源 • MCD以TRC增多为特征，UCD则表现为B网状细胞（BRC）增加 • FDC来源的VEGF与滤泡周围新生血管形成密切相关

信号通路机制

CD病灶中的FDC、TRC和PRC通过特异性配体-受体相互作用激活JAK-STAT、TGFβ和MAPK信号通路。

基质细胞活化及其介导的B细胞激活分化、新生血管形成与基质重塑是Castleman病的核心病理基础。

整合单细胞空间蛋白质组/转录组测序、DNA测序及拷贝数分析技术。

数据队列

结果1、细胞组成与空间分布

通过对645,285个RLN单细胞、1,768,327个UCD细胞及2,071,397个MCD淋巴结细胞进行免疫表型与空间分布分析，发现以下关键特征：

细胞群体差异

基础结构：所有组别均可见CD20+B细胞滤泡，其间分布CD3+T细胞、CD11b+髓系单核细胞、CD138+浆细胞、CD31/34+内皮细胞及CD45阴性DAPI+基质细胞（图1A） RLN特征：以淋巴细胞（B/T细胞）为主，非淋巴细胞占比极低

MCD vs RLN（置换检验q<0.01且|log2FC|>0.53）：

显著增加：内皮细胞、浆细胞、巨噬细胞、细胞毒性T细胞及基质细胞 显著减少：B细胞 共同变化：UCD与MCD均显示滤泡辅助性T细胞（Tfh）、调节性T细胞（Treg）和经典树突状细胞（cDC）减少

突出表现：

MCD1中非淋巴细胞占比超25% MCD3以非淋巴细胞为主要成分

FDC网络异常

数量特征：UCD/MCD生发中心的CD45阴性DAPI+基质核（符合FDC特征）较RLN显著增多

功能结构：

• FDC通过补体受体CD21（CR2）/CD35（CR1）向B细胞提呈抗原，其胞质网状结构对B细胞亲和力成熟至关重要
• CD21染色显示：FDC网状结构与B细胞同心层交错形成紧密互作，构成CD特征性的"洋葱皮"样套区结构

定量分析：

• 虽CD滤泡体积≤RLN，但CD21信号面积、亮度及图像熵（复杂度指标）在UCD/MCD中更高
• UCD滤泡内细胞香农多样性指数较低，与FDC核优势分布一致

病理机制提示

• 上述发现表明，FDC与其他基质细胞的异常活化/增殖可能是CD的核心发病基础。

CD的微环境特征与细胞互作网络

微环境异质性分析

通过对RLN、UCD及MCD样本的空间联合分析，鉴定了12种特征性微环境：

基础结构：

• B细胞生发中心
• CD4+T细胞、巨噬细胞或树突细胞富集的滤泡间区（与正常淋巴结结构一致）

CD特异性微环境：

• 巨噬细胞活化微环境：所有CD样本均出现滤泡间巨噬细胞富集区
• 血管重塑相关： ∙ MCD普遍存在两种内皮主导微环境（滤泡周与滤泡间） ∙ 浆细胞富集区见于所有MCD样本
• 亚型特异性分布： ∙ UCD1/2和MCD1：独特滤泡周内皮区与浆样树突细胞（pDC）区 ∙ MCD3/4：以滤泡间内皮/浆细胞微环境为主 ∙ MCD1：特殊套区微环境 ∙ MCD1/4：出现基质细胞富集的B细胞滤泡

细胞互作模式解析

• 距离分析： ∙ 采用Kolmogorov-Smirnov检验比较各样本细胞间距离分布与RLN差异 ∙ 设定<50μm为生物学相关互作阈值
• 关键异常互作： ∙ UCD/MCD显著改变：浆细胞、巨噬细胞、内皮细胞与其他细胞类型的互作网络 ∙ 病理意义：非淋巴细胞与淋巴细胞的异常空间邻近可能驱动CD发病

机制假说

研究提示：CD的特异性微环境通过重构基质-免疫细胞互作网络，破坏正常淋巴结功能架构。这种由局部细胞空间邻近性驱动的异常互作，可能是CD发病的核心环节。

结果2、CD扩增细胞群体的功能特征解析

单细胞蛋白质组学虽能精确定量CD主要细胞类型和微环境，但对细胞功能解析有限。为此，联合开展单核RNA测序（snRNA-seq）。

细胞群体动态变化

谱系鉴定：成功区分B细胞、浆细胞、T细胞、髓系单核细胞及基质细胞等群体

数量差异：

• RLN特征：生发中心B细胞核占主导
• UCD特异性：浆样树突细胞（pDC）、浆细胞和初始B细胞显著增加（q<0.01，|log2FC|>0.53）
• MCD特征： ∙ 浆细胞/增殖性浆母细胞 ∙ 内皮细胞/淋巴管内皮 ∙ 成纤维网状细胞（FRC） ∙ 单核/巨噬细胞及细胞毒性T细胞

技术一致性：尽管转录组数据中非淋巴细胞群体可能因解离偏差存在低估，但其扩增趋势与蛋白质组结果高度吻合

功能通路激活图谱

通过差异基因表达与通路富集分析，揭示关键病理机制：

基质细胞异常活化：

• FDC：胞质突起形成和血管生成通路激活
• FRC：VEGF、血管生成、MAPK和JAK-STAT通路显著上调（p<0.05）
• 共同特征：细胞外基质重塑相关通路普遍增强

免疫细胞功能失调：

• 巨噬细胞：炎症相关通路富集
• 记忆T细胞：CCL19/21结合、B细胞活化与增殖通路激活
• B细胞：IL-6通路介导的浆细胞分化
• 浆细胞：抗体产生通路增强

病理机制整合

研究结果表明：CD的发病涉及多细胞群体协同作用，包括基质细胞驱动的血管生成/基质重塑、巨噬细胞介导的炎症反应、T细胞活化以及IL-6依赖的B细胞-浆细胞分化。这些生理性免疫应答过程在CD中呈现病理性亢进状态。

基质细胞亚群与关键细胞因子的起源

基质细胞异质性解析

基于CD中关键通路在基质细胞的显著富集，对其进行了深度分析：

分群策略：

• 提取所有样本中非造血细胞的单核转录组数据
• 通过基质特异性标记物进行注释

亚群特征：

• 内皮细胞： ∙ CDH5+ENG+血液内皮细胞（BECs） ∙ PROX1+淋巴管内皮细胞（LECs）（在MCD中显著增多）
• 间质细胞： ∙ ACTA2+血管周网状细胞（PRCs） ∙ PDGFRA/B+CCL21highCCL19lowCXCL12+T区网状细胞（TRCs）（MCD优势群体）
• 滤泡区细胞： ∙ CXCL13+滤泡树突细胞（FDCs） ∙ FDCSP+CLU+B区网状细胞（BRCs）（UCD主要群体）

细胞因子溯源分析

针对CD特征性升高的循环VEGF和IL-6，我们进行了细胞来源定位：

VEGF表达谱：

• 主要来源：PRCs和TRCs（所有MCD样本中特异性高表达）
• 次要来源：FDCs（UCD1、MCD1和MCD3中表达）

IL-6相关基因模块：

• 高表达群体： ∙ MCD的PRC和CRC ∙ UCD的FDCs

核心发现：基质细胞是CD关键细胞因子的主要生产者

结果3、VEGF与IL-6表达基质细胞的空间定位

采用高灵敏度多重核酸原位杂交技术（RNAscope），对以下靶点进行共定位分析：

• 细胞因子：VEGFA、IL-6
• 细胞标记物：CD19（B细胞）、CXCL12/CXCL13（趋化因子）、PDGFRA（TRC）、ACTA2（PRC）

VEGF表达模式

总体特征：

• UCD与MCD均显示高VEGFA表达，但分布模式迥异
• UCD：表达局限于滤泡区
• MCD：滤泡与滤泡间区均显著高表达

细胞特异性定位：

• 滤泡内： ∙ 与CXCL13+胞质共定位 → 明确为FDC来源 ∙ 特征性表现为FDC核内强信号
• 滤泡间区： ∙ 与PDGFRA+基质细胞共定位 → 符合TRC特征 ∙ 与ACTA2+PRC共表达 → 血管周定位明确

IL-6表达特征

• 优势样本：MCD3/4呈现强表达
• 共表达模式： MCD3：IL-6/VEGF/PDGFR三重共表达 MCD4： ∙ IL-6/PDGFR共表达 ∙ IL-6+CD19+免疫母细胞 ∙ IL-6+ACTA2+PRC

转录组与蛋白质组数据的整合分析

技术整合策略

技术挑战：

• 单核RNA测序（snRNA-seq）鉴定了多个基质细胞亚群
• CODEX蛋白质组数据因缺乏特异性表面标记而难以精确区分这些亚群

解决方案：

• 采用MaxFuse算法整合转录组和蛋白质组数据
• 实现关键基质亚群在生发中心滤泡及其周围的空间定位

基质细胞空间分布特征

滤泡树突细胞（FDC）：

精确定位于CD21阳性网状结构中心 在UCD和MCD中数量显著增加

B区网状细胞（BRC）：

分布于RLN和UCD的滤泡内

血管周网状细胞（PRC）：

定位于血管壁 与血液内皮细胞（BEC）和淋巴管内皮细胞（LEC）明显不同

生发中心滤泡的精细解析

分析方法：

通过细胞微环境分析识别滤泡结构 采用100像素同心圆分层法

细胞分布模式：

B细胞：富集于滤泡区 CD4+T细胞：主要分布在滤泡周围区

血液内皮细胞（BEC）：

∙ 在滤泡周围区形成分布高峰 ∙ 与基质细胞分布峰值相邻（MCD中尤为显著）

病理意义：

内皮细胞对基质细胞分泌VEGF的趋化作用 解释了CD特征性的"棒棒糖"样穿透血管结构的形成机制

技术突破与发现

方法学创新：

首次实现snRNA-seq细胞分群结果向多重成像数据的精准映射 通过计算轮廓分层量化细胞亚群的空间分布

关键结论：

揭示了基质细胞-内皮细胞空间共定位的分子基础

为CD特征性血管改变提供了细胞层面的解释

结果4、基质细胞的配体-受体互作特征

基于单核RNA测序数据，通过LIANA算法联合Tensor-cell2cell分析平台，系统鉴定了驱动UCD和MCD的关键配体-受体互作网络。

疾病特异性互作模式

1. UCD特征性互作

核心通路激活：JAK-STAT、TGFβ和MAPK信号通路

主要互作类型：

胶原-整合素介导的细胞外基质（ECM）互作 补体系统驱动的炎症反应互作 PRC与巨噬细胞间的VEGF信号互作

亚型聚类：UCD1/2与MCD1/2共享部分特征因子，UCD3则与MCD3/4聚类

1. MCD特征性互作 核心通路激活：JAK-STAT、TGFβ、MAPK及TNF通路

细胞网络特征：

TRC通过胶原/SDC1（CD138）与浆细胞互作 TRC分泌VEGF与BEC表面受体结合 PRC与BEC/LEC的血管重塑相关互作（MCD4显著）

治疗靶点启示

研究发现：

基质细胞-免疫细胞轴：TRC/PRC通过VEGF-受体互作驱动血管异常增生 基质-浆细胞对话：胶原/SDC1介导的互作可能促进浆细胞存活

转化意义：靶向关键配体-受体对可望缓解MCD症状。

结果5、验证队列的空间转录组分析

对13例CD病例及对照（验证队列）进行了10x Xenium空间转录组分析。

结果6、DNA测序、免疫组库与病毒序列分析结果

基因组变异特征

临床级测序分析：

• 未检出具有临床意义的Tier 1/2级单核苷酸变异或拷贝数变异
• 发现意义未明的Tier 3级变异： ∙ UCD1/3和MCD1/4存在高变异等位基因频率（VAF）变异 ∙ 提示可能存在种系变异

既往报道变体重分析：

• 检测到极低频率变异（2-5/1000 reads）： ∙ PDGFRB p.N666S（UCD2） ∙ ALK p.R292H（UCD2/3，MCD1/3） ∙ BCOR p.G1289D（UCD3）

检出率接近Illumina测序错误率（1/1000），临床意义不确定

免疫组库分析

方法学：5′端测序分析T/B细胞受体

关键发现：

共鉴定1,631个单核TCR和6,556个单核BCR序列 未发现克隆性限制性B/T细胞群体

• 浆细胞特征： ∙ UCD3和MCD3/4的浆细胞呈现高频体细胞超突变 ∙ 主要类别转换为IgG1（附图6A-B） ∙ 提示滤泡网状细胞驱动的生发中心过程

病毒关联分析

检测策略：比对HHV8/HIV/EBV参考基因组

阳性结果：

仅在MCD4（HIV感染者）中检出HHV8序列 病毒序列主要富集于浆细胞

阴性结果：其他UCD/MCD/RLN样本均未检出HHV8/EBV/HIV

核心结论

本研究证实：滤泡网状细胞的活化与增殖通过分泌VEGF和IL-6，驱动了所有CD亚型共有的病理过程，包括：

• B细胞激活与浆细胞分化
• 病理性血管新生
• 基质重塑

最后来看看方法

单细胞数据分析

配受体分析

DNA分析

Xenium数据分析

生活很好，有你更好