三代测序100问（15）：三代纳米孔测序平台的DRS测序适合什么研究？

在转录组学的研究版图中，基于cDNA的测序方法无疑是应用最广泛的技术。然而，随着研究的深入，科学家们不再仅仅满足于知晓哪些基因被表达，更渴望探究RNA分子在细胞内的“原始”状态。最近，李老师就收到了这样一位同学的咨询：“我在测序服务商那里看到了直接RNA测序（DRS） 项目，这是什么技术？我的课题是否适合？” 今天，我们就来揭开Direct RNA Sequencing的神秘面纱，探究其无可替代的优势所在。

01 传统转录组测序：一份信息的“转译本”

在我们深入了解DRS之前，让我们先回顾一下最常见的转录组测序流程。无论是二代还是三代，常规方法通常都基于cDNA-PCR：

1. 首先，提取样本中的总RNA。
2. 然后，将RNA逆转录（Reverse Transcription） 成更稳定的互补DNA（cDNA）。
3. 接着，通过PCR对cDNA进行扩增，以获得足够的测序文库量。
4. 最后，构建文库并上机测序。

这个流程已经非常成熟和稳定，但它存在一个天然的限制：我们最终测序的并非RNA本身，而是经过“转译”和“复印”的cDNA。在这个过程中，两个关键的信息维度会不可避免地丢失：

• 扩增偏好性（Amplification Bias）： PCR过程并非绝对均匀，不同序列的扩增效率存在差异，可能导致最终的定量结果与真实的RNA丰度产生偏差。
• 碱基修饰信息的丢失： RNA分子上存在着超过170种化学修饰（如m6A, m5C, ψ等），这些修饰在调控基因表达、蛋白质翻译等方面扮演着至关重要的角色。然而，在逆转录成cDNA的过程中，这些宝贵的表观转录组（Epitranscriptome）信息被完全抹去。

02 直接RNA测序（DRS）：直击RNA的“原始手稿”

Direct RNA Sequencing（DRS），即直接RNA测序技术，其最大的不同点就在于——它彻底绕开PCR过程，直接将天然的RNA链送入纳米孔通道进行信号的采集和序列的测定。这种“所见即所得”的方式，带来了三大革命性的优势：

1. 完整保留RNA化学修饰：这是DRS最核心的优势。由于测序的是原始RNA分子，其上携带的各种化学修饰（如大家最熟悉的m6A、m5C等）会引起纳米孔电流信号产生特征性的微小变化。通过特定的算法，我们不仅能读出碱基序列，还能同时鉴定这些修饰的位置和类型。
2. 避免扩增偏倚，实现更精准的定量：因为没有PCR过程，测序reads的丰度能够更真实地反映细胞内RNA分子的实际表达水平。这对于需要精准定量的研究，例如比较不同条件下转录本的细微变化，具有非凡的意义。
3. 直接获取全长信息及Poly(A)尾长度：DRS能够直接读出一条完整的RNA分子，从5'端到3'端，清晰地展示其可变剪接形式。更为独特的是，它还能直接测量每个mRNA分子poly(A)尾巴的真实长度。Poly(A)尾的长度是一个重要的转录后调控元件，与mRNA的稳定性和翻译效率密切相关，而这是常规cDNA-PCR方法难以精确获取的。

0 3 DRS技术的应用场景

正因为上述优势，DRS技术在一些特定的研究领域中，几乎是无可替代的：

• 表观转录组学（Epitranscriptomics）：这是DRS最主要的应用领域。研究者可以利用DRS直接绘制全基因组范围内的RNA修饰图谱，探索RNA修饰在基因表达调控、疾病发生发展（如癌症、神经系统疾病）中的作用机制。
• Poly(A)尾长度与转录后调控研究：DRS是目前唯一能够大规模、高通量地直接测量内源性poly(A)尾真实长度的技术。研究mRNA poly(A)尾的动态变化及其对翻译效率和mRNA稳定性的影响，是揭示转录后调控新机制的金钥匙。
• RNA病毒基因组解析：对于RNA病毒（如流感病毒、冠状病毒），DRS能够直接对病毒基因组进行测序，无需逆转录和扩增。这在紧急疫情响应中尤为重要，能够更快、更全面地获得病毒的全貌，同时还能检测病毒RNA上可能存在的修饰。

04 平台现状

李老师指出：“现阶段，牛津纳米孔（ONT）是目前唯一能够商业化提供直接对天然RNA链进行测序的技术平台。 这项技术在国产的纳米孔测序平台上尚未商业化应用，因此各位老师和同学若想开展相应研究，暂时只能在ONT平台上进行。”

05 总结

总而言之，对于那些研究焦点在于RNA天然修饰、真核生物mRNA poly(A)尾长度动态，或是需要极高定量准确性的老师和同学们，可以积极尝试直接RNA测序。它为您打开了一扇直视RNA真实世界的窗户，说不定就能从中挖掘到全新的生命调控机制。

好了，这一期节目就到这里了，我们下期再见！