【生信分析】免疫组库基础分析7-CDR3长度分析

1.为什么要研究CDR3 长度

1.1 ‌CDR3区域定义‌

• CDR3是抗原受体（BCR/TCR）中变异度最高的互补决定区，由V(D)J基因重排形成。
• 锚点位置：起始端保守‌半胱氨酸（C）‌，结束端保守‌苯丙氨酸（F）/色氨酸（W）‌。
• 计算范围：从 C 后的第一个氨基酸到 F/W 前的最后一个氨基酸‌

1.2 CDR3长度是免疫多样性的核心指标‌‘ 1)决定抗原识别能力‌ CDR3 是 TCR/BCR 中直接接触抗原表位的区域，其长度多样性直接影响抗原结合的特异性与广度。较长的 CDR3 可形成特殊环状结构，识别隐蔽表位（如纳米抗体 CDR3 可达 16-18 个氨基酸）‌；而人类 TCR β 链 CDR3 通常为 8-12.5 个氨基酸，其长度分布反映 T/B 细胞克隆的多样性水平‌。 2)‌反映 V(D)J 重排特征‌ CDR3 长度由 V、D、J 基因片段的重排组合决定。例如，抗体重链长 CDR3 倾向使用 DH2/DH3-JH6 基因片段，短 CDR3 则依赖其他基因组合‌。在T细胞发育过程中，TCR要经历阳性选择与阴性选择，其CDR3长度因此也会进行过滤，避免过长或者多短CDR3的出现引发TCR过度活化。同样，BCR 也有类似的选择过程，如下图所示，IGH CDR3长度选择前后分布是不一样的，主峰位置不同。这种长度依赖性为解析免疫组库形成机制提供依据。

IGH CDR3 长度在选择前后不同

图1.CDR3 长度在选择前后不同

CDR3 长度分布作为免疫组库的“分子指纹”，其高斯分布特征（峰值约 12-18 个氨基酸）反映了进化优化的重排规律，而非随机事件‌。通过高通量测序量化这一参数，可解码免疫应答的克隆动态，为精准免疫诊疗提供基石

2.如何分析CDR3长度

2.1 CDR3 核苷酸长度与CDR3氨基酸长度

在免疫组库分析文件中，提供CDR3区域的DNA序列以及对应翻译出来的氨基酸序列。因此，对CDR3长度的分析包括：CDR3 核苷酸长度与CDR3氨基酸长度，后者在分析中更为常见。

2.2 In Frame 与Out of Frame CDR3序列

CDR3区域核苷酸长度由于并非都是3的倍数，因此有非3倍数长度的核苷酸最终无法翻译成氨基酸，所以也被称之为out of frame.这种非3倍数长度的CDR3序列总量可能占据总体的10%-40%。一般在25%左右。如下图所示，两种的长度分布也存在差异。

图2.Productive (In frame) CDR3序列与out of frame 序列分布的比较

2.3 如何处理非3倍数核苷酸长度的CDR3

解决方案1：根据是否为in frame 氨基酸来进行CDR3长度计算。排除非3倍数长度核苷酸长度的CDR3序列（这种在对于氨基酸序列中通常出现“-”，说明双侧向中间翻译注释的时候出现缺少或者插入核苷酸），同时排除氨基酸序列中出现中止密码子(星号*)的CDR3序列。

解决方案2：接受所有序列，只根据氨基酸长度来进行CDR3长度计算，将“-”，“*”符合均视为一个氨基酸长度。

2.4 In frame CDR3长度分布频率需要考虑的因素

1.当对CDR3长度进行了筛选，只选择in frame 氨基酸序列，如何计算CDR3氨基酸长度分布频率？

答：选择1：将所有inframe 氨基酸序列作为一个整体，重新根据这个整体count数计算分布频率（其总频率和=100%）。

选择2：将out frame与in frame的CDR3序列作为整体（100%），计算in frame氨基酸长度分布频率（其总频率总和<100%）

3. CDR3 长度分析的种类

3.1.CDR3 长度高斯分布分析

将X轴设置为核苷酸或者氨基酸不同长度数值，Y轴设置为百分比。展示每一个CDR3长度下对应的频率。

3.2.CDR3 长度平均分布分析

利用加权平均值来分析不同样本或者不同链的CDR3平均长度。

3.3.特定V/D/J 基因的CDR3 长度平均比较

如下图所示，图a展示了不同TRBV基因的相对频率。图b展示了不同TRBV基因所形成的CDR3的平均长度。在Y轴题目中注明了Weighted mean(加权平均值），在计算长度的时候，将对应该克隆或者CDR3序列的相对频率值进行了相乘。