文献分享（xenium）--肝内胆管癌三级淋巴结构异质性的时空图谱塑造免疫生态位与临床结局

作者，Evil Genius

马上国庆了，祝大家国庆节快乐，好好玩一玩。

今日我们分享文献

摘要

肝内胆管癌（iCCA）是一种高度致命的恶性肿瘤，治疗选择有限。iCCA中三级淋巴结构（TLSs）的空间架构和功能多样性仍不清楚。本研究呈现了TLS的多模态空间图谱，并识别出瘤内TLS（iTLSs）作为独立预后标志物。对214例发现队列和155例验证队列的bulk蛋白质组学分析识别出一个四级TLS-based肿瘤微环境分类系统，并支持开发TLS预测随机森林分类器。成像质谱流式显示iTLS⁺肿瘤具有结构化的免疫架构，其中M1样组织驻留巨噬细胞（RTMs）、树突状细胞（DCs）和CXCL13⁺CD4⁺T细胞共定位形成抗原呈递邻域（apc-CNs），与TLS核心区域（TLScore-CNs）空间耦合。单细胞空间转录组学进一步将61个TLS解析为14个空间生态位，并定义了一个伪时间成熟连续体：聚集型、激活型和后激活型。生态位内通讯主要由ifnCAFs、iCAFs和CXCL12⁺巨噬细胞介导，随成熟动态演化。单核RNA测序结合基于Tangram的空间映射揭示CXCL12⁺巨噬细胞和iCAFs在聚集型TLS中形成外周带，而ifnCAFs在激活期间浸润TLS内部。这些发现定义了TLS异质性，并为基质导向的免疫治疗提供了见解。

引言

iCCA的临床挑战

• iCCA是第二常见的原发性肝脏恶性肿瘤，以侵袭性临床行为和显著的分子异质性为特征，对有效治疗管理构成重大挑战。
• 尽管PD-(L)1阻断和靶向药物出现，临床获益仍限于特定患者亚群，强调需要更深入理解肿瘤微环境（TME）特征以指导更精确的治疗分层。

TLS的免疫学作用

• TLS已成为TME中的关键免疫组分，跨多种癌症类型的累积证据支持其在抗肿瘤免疫中的作用及对免疫治疗反应的预测价值。
• 在iCCA和相关肝胆恶性肿瘤中，TLS在空间分布和成熟状态上表现出显著异质性，对局部免疫反应有功能性后果。

TLS异质性的功能分歧

• 具体而言，瘤内TLS（iTLSs）——特别是含有生发中心的滤泡结构——与改善的患者生存和增强的CXCL13⁺CD4⁺T细胞招募相关，反映支持生产性T细胞-B细胞相互作用的能力。
• 相比之下，瘤周TLS可能通过调节性T细胞（Treg）富集导致免疫抑制，而未成熟聚集物（Agg）通常缺乏预后意义，突出TLS亚型的功能分歧。

TLS异质性在其他恶性肿瘤中的重现

• 在肝细胞癌中，未成熟TLS可进一步分为符合型和偏离型，只有前者表现出与成熟TLS相当的免疫治疗反应性。
• 类似地，在高 grade 浆液性卵巢癌中，TLS的空间成熟度在不同解剖部位差异显著，更发达的结构与增加的免疫活性和改善的结局相关。
• 这些发现汇聚于一个概念：TLS的空间架构、发育轨迹和免疫功能共同决定其临床相关性和治疗意义。

研究目标

• 尽管有这些见解，iCCA中TLS异质性的系统性、高分辨率图谱尚未建立。
• 为了解决这个问题，研究团队使用了整合空间多模态方法，结合bulk和空间蛋白质组学、单核RNA测序（snRNA-seq）和成像质谱流式（IMC）与单细胞空间转录组学。
• 通过这种空间多模态框架，识别出四种TLS-based TME亚型——Desertic（沙漠型）、Excluded（排除型）、Immature（未成熟型）和Structured（结构型）。

结果部分 1：iCCA中TLS分布、形态和预后的综合评估

TLS识别和空间注释

• 研究队列包括214例iCCA患者。TLS评估基于H&E染色，包括位置（iTLS vs pTLS）和成熟度（Agg、FL1、FL2）。
• 代表性H&E图像显示三种TLS形态亚型：淋巴聚集物（AGG）、初级滤泡（FL1）和次级滤泡（FL2）。
• 代表性CD20免疫组化染色突出B细胞丰富的TLS结构，支持形态分类。
• TLS分布密度图显示TLS相对于肿瘤边界的分布，证明主要在肿瘤边界5 mm内的局部化。
• Sankey图显示TLS成熟模式在瘤内和瘤周区室间的分布。每位患者基于最先进的形态学观察（层次：FL2 > FL1 > Agg > 无）被分配瘤内和瘤周区域的TLS状态。

四种TLS分类

• 基于TLS形态模式（Agg、FL1、FL2）及其空间分布，建立了四级TLS-based TME分类系统：
  • Structured（结构型）：存在iTLS
  • Excluded（排除型）：缺乏iTLS，但肿瘤区域外存在成熟TLS
  • Immature（未成熟型）：缺乏iTLS，所有pTLS均未成熟
  • Desertic（沙漠型）：完全没有iTLS或pTLS

预后分析

• Kaplan-Meier生存曲线显示TME亚型间总生存（OS）和无进展生存（PFS）显著不同。
• 多变量Cox回归分析显示iTLS存在是OS和PFS的独立预后因素。

结果部分 2：基于TLS的TME分类和预测分类器开发

发现队列和验证队列

• 发现队列：214例iCCA患者，来自bulk蛋白质组学分析。
• 验证队列：155例iCCA患者（n=155和n=5和n=14）。

随机森林分类器

• 基于bulk蛋白质组学数据构建随机森林分类模型预测iTLS状态（iTLS⁺ vs iTLS⁻）。
• 模型在发现队列（n=214）上训练，在独立验证队列（n=155）上验证。
• 训练集AUC：84.5%（77.1%-91.8%），测试集AUC：90.1%（80.0%-100.0%）。
• 验证集AUC：82.5%（67.8%-97.4%）。

TME亚型的蛋白质组学特征

• 热图显示四种TME亚型的Hallmark通路富集差异。
• Structured亚型富集免疫相关通路，Desertic亚型富集代谢和增殖通路。
• 单变量Cox回归分析显示多个蛋白质与预后相关。
• 混淆矩阵显示预测iTLS状态与实际iTLS状态的一致性。

空间蛋白质组学验证

• 验证队列中IMC和配对空间蛋白质组学分析进一步验证TME亚型的预后价值。
• 空间蛋白质组学热图显示不同TME亚型的细胞组成差异。

结果部分 3：TLS富集TME的单细胞空间架构

IMC分析

• 对代表TLS、免疫浸润区域和基质区室的严格选择ROI进行IMC分析。
• 验证队列中全切片水平生存分析重现亚型与OS的关联（P=1×10⁻⁴），并确认iTLS存在的预后价值（P=0.00011）。

结构型TME的特征

• 结构型TME以密集混合的T和B细胞形成紧密聚集为特征，这是成熟TLS组织的标志。
• 周围免疫丰富区域富集特化T细胞亚群，包括CXCL13⁺记忆CD4⁺T细胞、CD127⁺和PD1⁺CD4⁺T细胞以及naive CD4⁺T细胞。
• CD20、CD45RO和CD45RA的表达梯度进一步验证空间分层，得到CXCL13和CCL19空间蛋白质组学映射的证实。

空间邻近性分析

• M1样组织驻留巨噬细胞（RTMs）作为关键架构枢纽，与T/B细胞簇和CXCL13⁺CD4⁺T细胞形成紧密关联。
• 结构型肿瘤表现出最紧密的相互作用，而Desertic亚型以分散和连接不良的免疫区室为特征。
• 树突状细胞（DCs）也定位于TLS附近，尽管距离比M1样RTMs稍远。
• M1样RTMs和DCs显示比 other 髓系细胞更大的与T细胞亚群的细胞邻近性。
• 这些发现将M1样RTMs和DCs定位为TLS空间层级中的组织锚点。

结果部分 4：TME亚型特异性空间网络

空间分析框架

• 整合有效评分（ES）、成对细胞相互作用（PCI）和细胞邻域（CN）映射。
• M1样RTMs和DCs在结构型肿瘤的TLS区域显示峰值ES，表明其在成熟TLS中的功能区室化。
• PCI映射确认其与CXCL13⁺CD4⁺T细胞和T/B细胞簇的特权邻近性。

CN分析

• CN分析揭示两个功能 distinct 但空间耦合的邻域：
  • CN8：包含T细胞与M1样RTMs和DCs（抗原呈递邻域，apc-CN）
  • CN19：代表组织化T/B细胞聚集物（TLS核心区域，TLScore-CN）
• 区域富集分析显示CN19特异性定位于TLS区域，而CN8主要存在于TLS周围免疫细胞富集区域。

空间情境网络

• iTLS⁻肿瘤表现出比iTLS⁺肿瘤更高程度的区室化，表明更均匀和空间隔离的免疫组成。
• 相比之下，apc-CN和TLScore-CN等CN在iTLS⁺肿瘤中显示更大的空间优势和区室稳定性，表明APC-T细胞丰富TLS区域的协调扩展。
• iTLS⁺肿瘤显示apc-CN和TLScore-CN共现频率高于iTLS⁻肿瘤，其中CN配对更随机。
• CN9（内皮富集）在iTLS⁺肿瘤中与CN19（TLScore-CN）和CN8（T&APC富集）显示显著空间相互作用，与TLS和血管结构的共定位一致。
• 这些数据支持TLS组织的顺序模型：CN8中M1样RTMs和DCs的抗原呈递和CD4⁺T细胞激活先于淋巴细胞招募和空间组织进入CN19，最终建立成熟TLS架构。

结果部分 5：单细胞空间转录组学揭示TLS的分子状态

Xenium空间转录组学

• 使用10x Genomics Xenium对5例iCCA样本（4例iTLS⁺和1例iTLS⁻）的433,051个细胞进行profiling。
• TLS丰富区域显示经典标记物（如CXCL13、MS4A1、CR2和CD3E）的空间限制性表达，与细胞掩膜边界一致。
• 主要细胞类型及其亚型——包括 distinct T细胞、B细胞、基质和髓系谱系——在高分辨率下解析。

TLS鉴定

• 基于组织学评估，33%被分类为Agg，46%为FL1，21%为FL2。
• 使用组合空间和转录组学标准，跨样本识别出61个TLS结构。

TLS的分子异质性

• 将每个TLS作为pseudobulk单元，对其聚合基因表达谱进行主成分分析（PCA）。
• PC1和PC2捕获显著的分子异质性，关键TLS相关基因（如CXCL12、CXCL13、BANK1、CR2、RORC和IRF8）的表达梯度揭示连续而非离散的多样性。

伪时间转录状态

• 基于PCA定位和分子特征，将TLS分为三种伪时间转录状态：聚集型（Aggregated）、激活型（Activated）和后激活型（Postactivated）。
• 44%的TLS为聚集型，25%为激活型，31%为后激活型。
• 尽管这些亚型与常规组织学（Agg、FL1和FL2）部分重叠，但显著的类内变异性突出转录组分类的附加粒度。

细胞组成分析

• 聚集型TLS富集CXCL12⁺巨噬细胞、浆细胞和iCAFs。
• 激活型TLS以CXCL13⁺CD4⁺T细胞为特征。
• 后激活型TLS以TCF7⁺CD4⁺T细胞和Treg细胞为特征。

空间分布

• 测量每个TLS到最近肿瘤边界的距离。
• 聚集型和激活型TLS倾向于更靠近肿瘤边缘定位，而后激活型TLS更频繁地位于距肿瘤边缘更远的位置。
• 这种空间模式表明TLS成熟可能始于侵袭前沿附近，随后向更有组织的远端免疫区域进展。

结果部分 6：时空生态位重连和细胞间信号定义TLS成熟

14个空间生态位

• 系统映射TLS进展伪时间轨迹（聚集型、激活型和后激活型）中的14个空间分辨细胞生态位。
• 每个TLS阶段表现出 distinct 生态位组成和组织架构。

生态位组成

• 聚集型TLS富集含有iCAFs和CXCL19⁺CD8⁺T细胞的生态位，以及含有cDC2和CXCL12⁺巨噬细胞的抗原呈递生态位。
• 激活型TLS显示记忆B细胞、CXCL13⁺CD4⁺T细胞、产生干扰素（IFN）的CAFs、mregDCs和GZMK⁺CD8⁺T细胞富集的生态位显著扩展，与向协调免疫激活的转变一致。
• 后激活型TLS由TCF7⁺CD4⁺T细胞、Treg细胞和含有naive和增殖B细胞的生发中心样区域组成的调节性生态位主导。

生态位相互作用网络

• 生发中心和记忆B细胞区在每个TLS阶段形成 distinct 生态位-生态位相互作用枢纽。
• 在聚集型亚型中，生态位连接分析识别出iCAF和CXCL19⁺CD8⁺T细胞富集生态位与记忆B细胞和CXCL13⁺CD4⁺T细胞富集生态位以及cDC2和CXCL12⁺巨噬细胞富集生态位之间的显著空间相互作用。
• 激活型亚型表现出相互作用景观的重组，记忆B细胞和CXCL13⁺CD4⁺T细胞富集生态位占据中心网络位置，并显示与包括产生IFN的CAFs、mregDCs和GZMK⁺CD8⁺T细胞富集生态位在内的多样伙伴的增强连接。

Hallmark通路富集

• 聚集型TLS富集血管生成和TGF-β信号通路。
• 激活型TLS显示显著的IFN反应（IFN-α和IFN-γ）、IL-10信号、PD-1通路激活和CD3/TCR磷酸化。
• 后激活型TLS表现出氧化应激（ROS通路）、TNF-α通过NF-κB信号、炎症反应和IL-6-JAK-STAT3激活的增强特征，提示免疫调节巩固。

差异表达分析

• 聚集型TLS表达更高水平的CXCL6。
• 激活型TLS上调CR2、CXCL9和LAMP3。
• 后激活型TLS以IL-6和CCN1增加为标志。

生态位内信号

• 映射TLS成熟状态中的细胞通讯网络。
• 识别出强生态位内通讯回路，其中主要发送者细胞类型——如IfnCAF、iCAF、CXCL12⁺巨噬细胞和CXCL19⁺CD8⁺T细胞——与定位于同一生态位微环境中的接收细胞接合。
• 主导信号细胞群体的动态转变：聚集型TLS以CXCL12⁺巨噬细胞和iCAFs的显著信号为特征，而激活型TLS显示向产生IFN的CAFs作为主要信号发送者的转变。
• CXCL12介导的信号表现出阶段特异性模式：在聚集型TLS中，CXCL12信号主要来自巨噬细胞和iCAFs；在激活阶段，产生IFN的CAFs成为主要CXCL12来源；在后激活型TLS中，CXCL12信号在多种细胞类型中更均匀分布。

结果部分 7：snRNA-seq和空间映射揭示TLS相关免疫拓扑

snRNA-seq分析

• 使用10x Genomics Chromium Flex平台对14例iCCA样本（8例iTLS⁺和6例iTLS⁻）进行snRNA-seq。
• Desertic型iTLS⁻肿瘤被选择用于snRNA-seq以建立无TLS基线。
• 纳入可检测免疫浸润的病例以确保免疫亚型的充分代表性。

细胞群体

• 鉴定出105,226个细胞群体，包括上皮、浆细胞、肝细胞、循环细胞、CD31-基质、内皮、髓系、B细胞、T细胞等。
• T细胞进一步细分为GZMK⁺CD8⁺T、CD8⁺T、CD4⁺T、Treg、NK、NKT、GD T、ISG15⁺CD8⁺T、TCF7⁺CD4⁺T等。
• 髓系细胞进一步细分为cDC1、cDC2、mregDC、DC、CD14⁺Mono、CD16⁺Mono、CXCL12⁺Mac、LGMN⁺Mac、SPP1⁺Mac、IFN⁺Mac、MARCO⁺Mac、中性粒细胞、肥大细胞等。

Ro/e分析

• iTLS⁺肿瘤中TLS相关细胞类型（如CXCL13⁺CD4⁺T、记忆B细胞、GC B细胞）富集。
• iTLS⁻肿瘤中非TLS相关细胞类型（如中性粒细胞、CD11b⁺巨噬细胞）富集。

TLS生态位的空间分布

• 使用Tangram将Flex-derived细胞类型映射回Xenium空间坐标。
• CXCL12⁺巨噬细胞和iCAFs在聚集型TLS外周富集，形成环状分布。
• CXCL13⁺CD4⁺T细胞和记忆B细胞在激活状态浸润TLS中心区域。
• CXCL12⁺巨噬细胞显示M1相关基因高表达，并在M1-RTM签名中得分最高，强化其作为TLS成核的空间特权启动者的角色。

TLS相关生态位的临床相关性

• 五个TLS相关空间生态位的签名评分：
  • N3（cDC2和CXCL12⁺Mac富集）
  • N4（GC B细胞和Naive B细胞富集）
  • N5（iCAF、CCL19⁺T细胞和Mac富集）
  • N10（ifnCAF、mregDC和GZMK⁺CD8⁺T细胞富集）
  • N13（记忆B细胞和CXCL13⁺CD4⁺T细胞富集）
• 在三个独立免疫检查点阻断队列（GSE91061、GSE126044和PRJEB23709）中，这些签名评分在应答者与非应答者组间显示差异。
• Kaplan-Meier生存曲线显示这些TLS生态位签名评分与OS的关联。

讨论

核心发现

• 本研究呈现了iCCA中TLS的全面空间图谱，揭示其显著的分子和架构异质性。
• 通过基于TLS空间和形态特征将iCCA分为四种 distinct 免疫亚型，提出了解释肿瘤-免疫相互作用的框架。
• 值得注意的是，以iTLS存在为特征的结构型亚型被识别为独立预后因素，突出是TLS的空间配置——而非仅仅是存在——决定临床结局。
• 这一观察与其他肿瘤类型中的发现一致，同时也揭示了iCCA特异性的TLS生物学模式。

多模态策略

• 为实现对TLS异质性的多维理解，实施了整合多模态策略，结合bulk和空间组学平台。
• Bulk蛋白质组学实现大规模分子分层，并作为通过随机森林模型进行TME亚型分类的基础。
• IMC提供单细胞空间分辨率，但在多重和组织通量方面有限。
• 基于扩增的空间蛋白质组学提供更广泛的队列水平覆盖，尽管在pseudobulk分辨率。
• 为解决TLS内细胞架构，应用单细胞空间转录组学，允许免疫和基质亚型的高分辨率分类。
• 鉴于其较低的基因检测灵敏度，进一步纳入snRNA-seq以增强转录组深度和解析功能程序。
• 通过这些互补技术的协调使用，在多个分子和空间尺度捕获TLS相关特征——实现细胞类型、空间生态位、激活状态和通讯网络的交叉验证。

TLS功能生态位的细胞架构

• 空间蛋白质组和转录组分析强调功能TLS生态位形成需要精确的细胞架构。
• 具体而言，M1样RTMs、DCs和T细胞形成高度组织化的apc-CN，与TLScore-CN空间相互作用。
• 这种架构协调重现了淋巴结的微解剖结构，提示次级和异位淋巴部位间免疫细胞编排的保守范式。
• apc-CN作为TLS生态系统中关键调节枢纽的识别提供了几个机制见解：
  • 通过snRNA-seq的转录分析揭示CXCL12⁺巨噬细胞（M1样RTM表型）和DCs中抗原呈递通路的富集，暗示其在局部T细胞priming中的作用。
  • 其与CXCL13⁺CD4⁺T细胞的紧密空间邻近性提示在维持TLS相关趋化因子梯度（如CXCL12和CXCL13）中的功能。
  • 其与TLScore-CN的相互作用网络暗示对体液免疫的潜在支持。

TLS成熟的伪时间连续体

• 利用Xenium空间转录组学，进一步将TLS解析为分子亚型的伪时间连续体——聚集型、激活型和后激活型。
• 早期阶段由iCAFs、CXCL19⁺CD8⁺T细胞和APC样髓系亚群（包括cDC2s和CXCL12⁺巨噬细胞）共富集的生态位主导，形成协调空间相互作用网络，提示TLS起始和免疫招募。
• 随着TLS向激活状态转变，以CXCL13⁺CD4⁺T细胞和记忆B细胞为特征的生态位成为主导枢纽，表明向生发中心样免疫架构的进展。

与传统组织学分类的比较

• 基于基因表达的TLS亚型分类只能部分与H&E染色形态识别的TLS成熟度对齐。
• 这表明传统的TLS成熟度聚类策略不足以区分预激活或后激活的TLS。
• 这要求开发更可靠的TLS聚类方法，与临床结局密切相关。

snRNA-seq验证

• 使用10x Chromium Flex平台对14例iCCA样本进行snRNA-seq。
• 该方法能够精细识别TLS相关免疫和基质亚型，包括CXCL13⁺CD4⁺T细胞、记忆B细胞和CXCL12⁺巨噬细胞。
• 使用Tangram将Flex-derived细胞类型映射回Xenium空间坐标，揭示跨平台的强空间一致性。
• 具体而言，CXCL12⁺巨噬细胞和iCAFs在聚集型TLS外周富集并形成环状分布，而CXCL13⁺CD4⁺T细胞和记忆B细胞在激活状态浸润TLS中心区域。
• CXCL12⁺巨噬细胞显示M1相关基因高表达，并在M1-RTM签名中得分最高，强化其作为TLS成核的空间特权启动者的角色。
• CXCL12⁺巨噬细胞分泌CXCL12、TNF和IL2RA可能编排免疫细胞招募和空间组织——CXCL12引导cDC2和淋巴细胞定位，TNF增强基质激活和淋巴趋化因子产生（如CCL19），而IL2RA可调节局部T细胞存活，共同强化TLS聚集。
• 这些结果支持一个逐步模型，其中趋化因子产生、抗原呈递和CD4⁺T细胞激活由M1样RTMs和DCs先于淋巴细胞招募和滤泡组织，最终建立成熟TLS架构。

临床意义

• 从蛋白质组学特征衍生的随机森林分类器可作为TLS-based肿瘤分层的诊断工具。
• 对M1样RTM和apc-CN功能的机制见解提示治疗性TLS调节的机会——要么通过促进其空间组装，要么通过重编程免疫抑制对应物。
• 在先前的工作中，研究团队识别出M2样RTMs作为通过抑制CD8⁺T细胞介导免疫治疗耐药的介质，其与CD8⁺细胞的空间邻近性与iCCA不良临床结局相关。
• 基于这些发现，将M2样重编程为M1样RTMs成为增强抗肿瘤免疫的合理策略。
• TLS分类的整合框架——跨越形态学、空间蛋白质组和转录组维度——为临床实施提供了潜在基础。
• 用于定义TLS成熟度的组织学标记物（CD20、CD3、CD21、BCL6和Ki-67）均与常规免疫组化平台兼容，可适用于活检水平评估。
• 半定量TLS成熟度评分可能因此作为识别具有iCCA和“免疫热”TMEs、更可能从免疫治疗中获益的患者的可行生物标志物。

局限性

• 分析主要是观察性和描述性的。
• 未来使用遗传操作模型的研究需要验证M1样RTMs与TLS形成之间的因果关系。
• 纵向空间 profiling 可能阐明TLS成熟状态是稳定亚型还是演化中的肿瘤-免疫生态系统内的瞬态阶段。

总结

• 空间生态系统分析重新定义了iCCA中TLS生物学的景观。
• 显示协调的细胞重组和生态位水平重塑是TLS异质性的基础，对生物标志物开发和治疗靶向均有意义。
• 这些见解为未来旨在利用或重新工程化TLS以克服这种挑战性恶性肿瘤中免疫耐药的策略提供了基础。

方法

组织病理学分析

• 所有内部队列患者使用标准化协议评估。
• 研究按照赫尔辛基宣言原则进行，获得中山大学肿瘤防治中心（SYSUCC）医学伦理委员会批准（批准号B2024-665-01）。
• H&E染色在4 μm FFPE iCCA组织切片上按照标准协议进行。
• TLS在H&E染色切片上被识别为肿瘤区域内或附近的离散淋巴聚集物。
• 当连续的CD20⁺和CD3⁺淋巴细胞簇面积超过7000 μm²且含有至少100个淋巴细胞时，结构被认为是TLS阳性。
• TLS成熟度分为三类——Agg、FL1和FL2——基于组合形态学和免疫组化标准。

免疫组化染色

• 使用BOND RX系统（Leica Biosystems）在4 μm FFPE切片上进行自动IHC。
• 使用以下一抗：抗CD20、抗CD21、抗CD3、抗BCL6和抗Ki-67。
• 使用BOND Polymer Refine Detection Kit进行检测，DAB显色。

样本制备和蛋白质组分析

• FFPE组织样本通过顺序脱蜡和蛋白质提取步骤处理，然后进行MS分析。
• 使用压力循环技术（PCT）进行蛋白质提取。
• 在Vanquish Neo UHPLC系统耦合Orbitrap Astral质谱仪上进行LC-MS/MS分析。
• MS数据使用DIA-NN软件处理，针对UniProt人类参考蛋白质组数据库。

随机森林模型构建和验证

• 使用R包ranger构建随机森林分类模型预测iTLS状态。
• 模型在发现队列（n=214）上训练，在独立验证队列（n=155）上验证。
• 进行10次独立训练迭代，每次使用不同的随机种子。

基因集富集分析和GO分析

• 使用MSigDB的hallmark基因集进行GSEA。
• 使用clusterProfiler R包进行KEGG通路富集分析。

免疫架构分析

• 使用imcRtools包的buildSpatialGraph函数构建k-最近邻图。
• 通过k-means聚类（k=20）基于细胞表型和空间关系识别CNs。
• 使用testInteractions函数计算所有可能细胞类型对之间的相互作用频率。
• 使用minDistToCells函数计算最小细胞间距离。

Xenium原位空间转录组分析

• 使用Xenium In Situ平台（10x Genomics）进行高分辨率空间转录组 profiling。
• 使用Seurat的BuildNicheAssay函数构建生态位分析。
• 使用qgraph R包进行网络可视化。

Xenium中TLS状态识别

• 在Xenium explorer软件中基于组织学和分子特征识别61个TLS结构。
• 对每个TLS进行PCA，基于PC1和PC2进行k-means聚类（k=3）。
• 定义三种伪时间TLS状态：聚集型、激活型和后激活型。

FFPE组织的snRNA-seq

• FFPE组织（50 μm）使用Liberase TH Research Grade解离。
• 使用Chromium Fixed RNA Profiling Kit进行文库制备。
• 在Illumina NovaSeq X Plus系统上测序。
• 使用Seurat R包（版本4.4.0）进行质量控制和整合。
• 使用Tangram包将10x Flex测序数据空间映射到10x Xenium数据。

统计分分析

• 所有统计分析使用R软件（版本4.4.1）和Python软件（版本3.12.7）进行。
• 使用Cox比例风险模型比较生存结局。
• 统计显著性确定如下：P < 0.05，P < 0.01，**P < 0.001。

最后总结

1. 四种TLS-based TME亚型：Structured、Excluded、Immature和Desertic，其中Structured亚型（存在iTLS）是独立预后因素。
2. 随机森林分类器：基于bulk蛋白质组学数据预测iTLS状态，训练集AUC 84.5%，测试集AUC 90.1%，验证集AUC 82.5%。
3. TLS空间架构：M1样RTMs、DCs和CXCL13⁺CD4⁺T细胞共定位形成apc-CNs，与TLScore-CNs空间耦合，重现淋巴结微解剖结构。
4. TLS成熟伪时间连续体：聚集型、激活型和后激活型，每个阶段具有 distinct 生态位组成、信号网络和功能特征。
5. 14个空间生态位：TLS进展中生态位组成和组织架构动态变化，生发中心和记忆B细胞区形成 distinct 相互作用枢纽。
6. CXCL12⁺巨噬细胞和iCAFs：在聚集型TLS外周形成环状分布，作为TLS成核的空间特权启动者。
7. ifnCAFs：在激活期间浸润TLS内部，成为主要CXCL12来源。
8. 临床意义：TLS相关生态位签名评分在免疫检查点阻断队列中区分应答者与非应答者，并与OS相关。TLS成熟度评分可作为识别可能从免疫治疗中获益的iCCA患者的可行生物标志物。
9. 治疗策略：将M2样重编程为M1样RTMs是增强抗肿瘤免疫的合理策略。

生活很好，有你更好。