文献分享--PD-1阻断后肿瘤浸润浆细胞谱分析揭示肿瘤特异性抗体

作者，Evil Genius

大家平时有空多看看文献，看看最前沿都在干什么，以及有什么突破的医疗技术。

今日分享文献，现在真的是得多组学得天下。

Graphical Abstract（图形摘要）

Mining Tumor Antibodies（挖掘肿瘤抗体）：

• NSCLC肿瘤经PD-1阻断治疗后，肿瘤内出现富含浆细胞的三级淋巴结构（TLS）
• 通过单细胞测序对肿瘤浆细胞进行BCR挖掘
• 重组抗体发现：PC-1 mAb

Translational Application（转化应用）：

• PC-1识别肿瘤细胞和髓系细胞表面的瓜氨酸化抗原
• PC-1 CAR T细胞消除肿瘤和抑制性髓系细胞
• 内源性肿瘤体液免疫可被挖掘，用于发现抗体靶点并开发下一代免疫疗法

Highlights（亮点）：

1. PD-1阻断与肿瘤特异性抗体开发相关
2. 单细胞BCR挖掘识别肿瘤选择性抗体谱系
3. 肿瘤抗体结合癌症细胞和促肿瘤髓系细胞上的瓜氨酸化抗原
4. PC-1 CAR T细胞靶向肿瘤和促肿瘤髓系细胞，无脱靶毒性

摘要

背景： 肿瘤浸润B细胞（TIL-Bs）在免疫检查点阻断背景下对抗肿瘤反应的作用尚不完全清楚。

方法： 研究团队分析了接受新辅助PD-1阻断治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者切除肿瘤中的体液免疫反应。

主要发现：

1. 肿瘤组织形成含有CD138⁺浆细胞的三级淋巴结构（TLS）
2. 利用体细胞超突变和类别转换的B细胞受体（BCR）克隆重组单克隆抗体（mAbs）
3. 多个mAbs结合细胞表面瓜氨酸化蛋白，这是癌细胞的典型特征
4. 领先候选抗体PC-1的scFv重定向的CAR T细胞在体内特异性靶向肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞，无脱靶活性
5. 在荷瘤小鼠中敲除瓜氨酸化酶PADI2可消除对PC-1的反应性和CAR的细胞毒性杀伤

结论： 肿瘤浸润浆细胞具有治疗潜力，可用于癌症治疗。

引言

TIL-Bs的重要性：

• 越来越多证据表明TIL-Bs在抗肿瘤免疫反应和阻碍肿瘤进展中起重要作用
• TIL-Bs发挥多种作用：向T细胞呈递抗原、调节T细胞功能、分泌抗肿瘤抗体
• TIL-Bs与多种癌症（软组织肉瘤、胰腺导管腺癌、NSCLC）的生存改善相关

PD-1阻断与B细胞：

• PD-1免疫检查点阻断的经典机制是促进抗肿瘤T细胞反应
• 新兴证据表明PD-L1阻断也影响B细胞反应
• 新辅助PD-1阻断试验报告：NSCLC切除标本中TLS成熟度和丰度增加
• TLS丰度增加与主要病理缓解和无病生存相关
• 肿瘤内CD138⁺浆细胞频率增加与PD-1阻断后临床结局改善相关

研究空白：

• NSCLC患者中浸润浆细胞的抗肿瘤作用 largely unknown
• 尽管已有TIL-Bs的图谱研究，但BCR的肿瘤抗原特异性研究较少

CAR T细胞治疗的挑战：

• 实体瘤（包括NSCLC）的CAR T治疗正在积极研究
• 关键挑战：识别具有足够肿瘤限制性的抗原以最小化on-target, off-tumor毒性
• 髓系细胞和成纤维细胞驱动的免疫抑制是障碍

研究思路：

• 抗PD-1治疗的肿瘤中浆细胞积累，可能是肿瘤细胞特异性抗体的丰富来源
• 利用NSCLC患者肿瘤样本，通过高通量技术测序TIL-B BCR基因
• 定义TIL-B群体，选择BCR序列进行功能表征
• 开发PC-1 CAR T构建体，证明其杀伤肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞而无脱靶效应

结果一、PD-1阻断后NSCLC肿瘤中浆细胞积累

临床 trial 背景：

• 研究基于 TOP1501临床试验（NCT02818920），单臂II期研究，评估 pembrolizumab 在临床IB、II或IIIA期NSCLC患者手术切除前的疗效
• 该 trial 证明了安全性和可行性，以及令人鼓舞的主要病理缓解、无进展生存期和总生存期

样本选择：

• 从该研究中具有足够库存样本的手术切除肺肿瘤中，鉴定出 5例 切除后肿瘤标本，这些标本在流式细胞分析中存在TIL-Bs，并且有足够的库存样本用于研究
• 样本类型：
  • 石蜡包埋肿瘤：患者 001、004、006
  • 解离肿瘤：患者 004、201、301

研究动机：

• TIL-Bs与多种癌症（包括NSCLC）的生存改善相关
• PD-1阻断影响B细胞反应
• 因此，研究首先试图确定PD-1阻断如何增强NSCLC中的肿瘤内体液免疫反应

结果二、PD-1阻断后NSCLC肿瘤中TLS形成

方法：

• 使用 CODEX多重免疫荧光 assay 研究TLS密度和免疫细胞组成
• 分析了3例有石蜡包埋组织可用的患者（001、004、006）的治疗后NSCLC切除标本，包括患者004的治疗前核心针活检标本

主要发现：

• 与患者004的治疗前活检相比，3例患者治疗后的切除肿瘤均含有 大量TLS
• 包括 成熟TLS：含有GC CD4⁺ T细胞和Ki67⁺CD20⁺ B细胞，被 CD138⁺CD38⁺ ASCs 包围
• 这表明肿瘤内TLS中T细胞和B细胞之间存在 cross-talk，以及随后的TIL-B多样化和ASC生成
• 此外，观察到 CD138⁺CD38⁺ ASCs 在肿瘤 stroma 和 parenchyma 中普遍积累，暗示这些细胞在TME中的作用尚未充分研究

TLS成熟度分析：

• 通过细胞类型邻域分析，TLS内的细胞被分组为空间连贯的斑块
• TLS成熟度由 B细胞富集 和 Ki67表达（增殖活性标志）定义，分为三组：

1. 未成熟（immature）
2. 静息成熟（quiescent mature）
3. 增殖成熟（proliferating mature）

• 如预期，增殖成熟TLS中Ki67表达高于静息成熟和未成熟TLS
• 不同标本间TLS成熟状态差异不大，与病理缓解率也无关联，可能与手术切除标本的采样变异性有关

结论：

• PD-1阻断背景下的TME可能促进支持肿瘤B细胞发育的环境

结果三、NSCLC中总TIL-B细胞群体的单细胞谱分析

背景：

• 成熟TLS的存在暗示了抗原驱动的阳性选择和TIL-B分化

方法：

• 使用scRNA-seq和BCR测序对TIL-B群体进行高分辨率表征

主要发现：

• 鉴定出 7个主要B细胞cluster：

1. Naive-like B
2. Activated naive B
3. Cycling B
4. Germinal Center (GC) B
5. Memory B (MBC)
6. Atypical Memory (AtM) B
7. Antibody-secreting cells (ASCs)

• 这些群体显示了与先前发表研究对应的基因表达谱：
  • Naive-like B：TCL1A、YBX3、FCER、IGHD富集
  • Activated naive B：CD83、MIR155HG、NFKB1、CD69、CD83
  • Cycling B：MKI67、STMN1、HMGB2
  • GC B：BCL6、AICDA
  • MBC：CD27、TNFRSF13B
  • AtM B：DUSP4、FCLR5、ZEB2、ITGAX (CD11c)
  • ASCs：MYDGF、JCHAIN、XBP1、MZB1
• 基因集分析进一步验证了TIL-B注释的分子表型
• 由于数据集中TIL-Bs数量较少，未进一步细分这些群体

BCR分析：

• 结合计算重建的BCR序列与注释的scRNA-seq数据，获得 5,281个功能性重链-轻链配对
• Naive-like B 以IgM和IgD同种型为主
• GC、MBC、AtM、ASC 显示多种同种型，表明这些群体中发生了类别转换
• 体细胞超突变（SHM）：
  • Naive-like B：平均SHM频率较低
  • GC、MBC、ASC：SHM频率较高
• 可变重链、kappa或lambda基因家族使用在TIL-B群体间无 major 差异
• 可变重链和轻链使用在TIL-B群体间无显著差异
• 鉴定出 39个共享克隆谱系（其中12个表达为重组mAbs），表明NSCLC肿瘤内TIL-B分化和克隆扩增

5.4 不同TIL-B细胞群体来源抗体的肿瘤反应性

背景：

• 先前观察到NSCLC中PD-1阻断后肿瘤内ASCs扩增
• 研究试图研究抗原经历过的肿瘤反应性ASCs的免疫遗传学特征

方法：

• 解离肿瘤富集 CD138⁺ B细胞，随后对配对重链（VH）和轻链（VL/VL）基因进行BCR测序
• 从患者004获得 1,353个 独特BCR克隆型，从患者301获得 1,671个

主要发现：

• 两名患者均观察到TIL-Bs克隆扩增（每个克隆型有多个成员）
• 可变重链（VH）、可变kappa（VK）和可变lambda（VL）基因家族在TIL-B ASCs中最常见
• 肿瘤来源的VH、VK和VL基因发生突变，暗示这些ASCs的抗原驱动成熟
• 肿瘤浸润ASCs主要类别转换：
  • IgG1 最常见（患者004：60.5%；患者301：43.3%）
  • 其次是 IgA1（患者004：23.8%；患者301：13.5%）

重组mAb生产与测试：

• 从患者004和301生产 15个重组mAbs，代表最扩增的TIL-B ASC克隆型
• 平均VH和VL突变频率分别为 5.3% 和 3.5%，HCDR3长度为 15个氨基酸
• 这些B细胞均为类别转换（IgG1最常见），重链和轻链基因使用多样
• 每个抗体通过免疫荧光染色评估结合 Calu-6 NSCLC细胞系 细胞表面表达抗原的能力
• 11/15（73%） mAbs显示不同程度的细胞表面抗原反应性

扩展分析：

• 仅研究最扩增的TIL-B ASC克隆型可能遗漏其他TIL-B群体的强效抗肿瘤抗体
• 因此，又生成 17个重组mAbs，来自GC、MBC和AtM TIL-B群体，以及 12个重组mAbs，来自较少克隆扩增但高度突变或高度多样化的ASC克隆谱系
• 平均VH和VL突变频率分别为 8% 和 5%，HCDR3长度为 16个氨基酸
• 这些B细胞均为类别转换（IgG1最常见），重链和轻链基因使用多样
• 每个抗体通过免疫荧光染色评估结合 A549 NSCLC细胞系 细胞表面抗原的能力
• 15/29（52%） mAbs显示细胞表面抗原反应性，表明肿瘤抗原反应性存在于抗原经历过的TIL-B群体中，包括GC、记忆和AtM B细胞群体，以及ASCs

PC-1的选择：

• 在29个mAbs中，PC-1 显示最强的细胞表面反应性
• PC-1是ASC repertoire中最克隆扩增的谱系之一， recovered 107个成员
• 这些数据表明，在这个代表性抗体谱系中，ASC谱系对肿瘤抗原的显著成熟；因此，选择 PC-1 作为领先肿瘤反应性抗体进行进一步研究

结果5、瓜氨酸化波形蛋白是肿瘤抗体的常见靶点

背景：

• PC-1 mAb对Calu-6 NSCLC细胞系显示强细胞表面结合
• 研究决定进一步研究该抗体对其他解剖来源癌细胞系细胞表面抗原的反应性

主要发现：

• PC-1结合多种解剖来源肿瘤细胞表面抗原：肺、间皮瘤等
• 通过 免疫沉淀、质谱和候选优先级标准 进行抗原发现
• PC-1结合瓜氨酸化波形蛋白（citrullinated vimentin）
• 表面等离子共振分析PC-1与候选抗原的结合，列出动力学和亲和力
• PC-1和其他肿瘤来源抗体结合 环状瓜氨酸化肽（CCPs） 的ELISA
• PC-1自身反应性测试：针对临床相关核自身抗原的 multiplex 免疫荧光 assay
  • 4E10（已知多反应性/自身反应性抗HIV-1 mAb）作为阳性对照
  • CH65（抗流感血凝素mAb）作为阴性对照
• PC-1结合多特异性评估：针对23,004种人类蛋白的HuProt微阵列（CDI Labs）
• PC-1种系回复和 consensus "mature" 序列比对
• 种系回复PC-1和成熟PC-1结合瓜氨酸化肿瘤抗原 的ELISA

补充发现：

• PC-1也结合瓜氨酸化 calreticulin、p53、Hsp90
• PC-1不结合环状瓜氨酸化肽（CCPs）
• 序列比对未揭示明显的共享线性表位
• 研究推测瓜氨酸化暴露或稳定了共享的构象特征，而非作为唯一结合决定因素
• 尽管PC-1对瓜氨酸化波形蛋白的亲和力高于未修饰蛋白，但PC-1 mAb不与环状瓜氨酸化肽反应，表明瓜氨酸的存在本身并非该谱系结合的必要条件
• PC-1在瓜氨酸化波形蛋白上的表位定义仍是 active investigation 的领域

结果6、PC-1结合患者来源的肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞

方法：

• 流式细胞术分析PC-1结合新鲜解离的HGSOC肿瘤（4例患者）中的肿瘤细胞和肿瘤相关T细胞
• 流式细胞术分析PC-1结合肿瘤相关CD4⁺或CD8⁺ T细胞
  • CD4⁺ T细胞评估PD-1和TIM-3表达作为终末耗竭标志
• 流式细胞术分析PC-1结合健康供体或HGSOC患者PBMCs（各4例）
• 流式直方图比较PC-1结合肿瘤相关巨噬细胞（CD45⁺CD14⁺DR⁺）、M-MDSCs（CD45⁺CD14⁺DR⁻）和淋巴细胞（CD3⁺CD45⁺），在CTCL、NSCLC和HGSOC肿瘤中
• 健康供体PBMCs作为对照

主要发现：

• PC-1结合HGSOC肿瘤细胞，但不结合肿瘤相关T细胞
• PC-1结合肿瘤相关CD4⁺或CD8⁺ T细胞（评估PD-1和TIM-3表达）
• PC-1结合HGSOC患者PBMCs，但不结合健康供体PBMCs
• PC-1结合肿瘤相关巨噬细胞和M-MDSCs，但不结合淋巴细胞

结果7、PC-1 CAR T细胞在免疫competent小鼠癌症模型中显示抗肿瘤活性和改善生存

体外细胞毒性：

• CD28和4-1BB共刺激的PC-1 CAR T细胞在体外杀伤Calu-6和A427 NSCLC细胞， compared with mock-transduced controls：
  • Calu-6细胞指数降低 80% 和 92%
  • A427细胞指数降低 64% 和 60%
  • 通过Xcelligence体外细胞毒性 assay 测量

体内异种移植模型：

• 在NSG异种移植模型中，CD28共刺激的PC-1 CAR T细胞控制已建立的Calu-6和A427肿瘤生长， compared with mock-transduced T细胞
• PC-1也结合A427-bearing Rag1⁻/⁻小鼠的鼠肿瘤相关巨噬细胞和脾巨噬细胞，支持使用免疫competent模型评估活性和潜在毒性

PAD2依赖性：

• 生成 PAD2缺陷的A427细胞
• PAD2缺失使PC-1表面结合从亲本A427细胞的 82.6% 降至 6.4%
• PAD2缺失消除了CD28或4-1BB共刺激的PC-1 CAR T细胞的杀伤
• 这些数据支持 PAD2依赖性瓜氨酸化细胞表面抗原 是PC-1 CAR T细胞的功能相关靶点

免疫competent小鼠模型：

• 人和鼠波形蛋白共享 >97%同一性，包括精氨酸残基的保守
• 为测试鼠癌症能否将瓜氨酸化波形蛋白转运到肿瘤相关髓系细胞表面，用 orthotopic ID8-Defb29/Vegfa肿瘤 挑战B6小鼠，这是团队生成的腹水模型
• 为在免疫competent环境中评估PC-1 CAR T活性，生成 鼠源化CD28共刺激CAR T细胞：
  • 使用PC-1 VH和VL CDR序列
  • 整合到高度相似的 IGHV1-8001/IGHJ101; IGKV8-3001/IGKJ203 IgG1骨架** 中，以防止体内中和
  • 使用PC-1抗体的鼠源化scFv生成CD28共刺激小鼠CAR T细胞，使用 conventional 人类CAR T细胞信号基序的鼠对应物
• 鼠源化PC-1 CAR T细胞在体外杀伤鼠 KPM 和 UPK10 肿瘤细胞，细胞指数分别降低 65% 和 44%

讨论

TME与PC-1结合特性：

• TME提供慢性炎症微环境，特征是持续细胞应激、细胞死亡、缺氧、髓系激活和组织重塑
• 这可能解释为什么PC-1识别癌细胞和癌症相关免疫/基质细胞，但对配对正常组织或健康供体PBMCs结合有限

PC-1交叉反应机制：

• PC-1与瓜氨酸化波形蛋白、calreticulin、p53和Hsp90交叉反应的机制尚未解决
• 这种表型与先前报道的卵巢癌和黑色素瘤中多反应性肿瘤抗原反应性抗体一致
• 这种多反应性可能有利于克服肿瘤内和肿瘤间的抗原多样性
• 序列比对未揭示明显的共享线性表位，PC-1不结合环状瓜氨酸化肽
• 研究怀疑瓜氨酸化暴露或稳定了共享的构象特征，而非作为唯一结合决定因素
• 尽管PC-1对瓜氨酸化波形蛋白的亲和力高于未修饰蛋白，但PC-1 mAb不与环状瓜氨酸化肽反应，表明瓜氨酸的存在本身并非该谱系结合的必要条件
• PC-1在瓜氨酸化波形蛋白上的表位定义仍是 active investigation 的领域

CAR T开发挑战与PC-1的优势：

• 免疫检查点阻断的持久反应仅限于部分患者
• 辅助疗法如CAR T细胞治疗正在研究作为实体瘤（包括NSCLC）的有吸引力的策略
• CAR T可以重定向自体T细胞对抗肿瘤相关表面抗原，绕过内源性抗原呈递，介导对恶性细胞的直接细胞毒性
• CAR T开发的关键挑战：识别具有足够肿瘤特异性的抗原以最小化毒性
• 此外，髓系细胞和成纤维细胞驱动的免疫抑制是有效肿瘤内T细胞积累、效应活性和长期持久性的 substantial barrier
• 值得注意的是，PC-1的靶点 瓜氨酸化波形蛋白 不仅在肿瘤细胞表面表达，也在促肿瘤髓系细胞表面表达
• 当开发成携带PC-1 mAb特异性的CAR T构建体时，该构建体也杀伤肿瘤和促肿瘤髓系细胞（且无有害脱靶效应），提供了强有力的概念验证数据，支持挖掘肿瘤抗体 repertoire 用于开发新型肿瘤治疗剂

总结：

• 研究提供了TIL-B反应的计算分析平台，能够快速、高通量、抗原不可知地分离肿瘤反应性抗体
• 证明了异质性TIL-B群体中存在肿瘤抗原反应性，这些群体作为抗肿瘤体液免疫反应的一部分发展
• 更重要的是，识别患者来源mAbs及其 cognate 抗原可能有助于开发新的肿瘤疗法，如抗体-药物偶联物和CAR T细胞，并作为未来癌症疫苗平台的候选肿瘤抗原

研究局限性

• 研究受限于临床标本数量少，新辅助检查点阻断后残留组织和浆细胞浸润有限
• 组织可用性有限也妨碍了系统分析配对 adjacent normal lung tissue 或引流淋巴结作为前体B细胞潜在来源
• 由于从 selected clonally expanded、高度突变或多样化的BCR谱系生产抗体，方法可能低估了肿瘤反应性TIL-B特异性的 full diversity
• 无法确定研究的抗体分泌细胞是在肿瘤内TLS中产生还是从系统循环迁移到TME
• 由于治疗研究聚焦于肿瘤来源抗体的Fc非依赖性应用，未评估Fc依赖性效应功能如ADCC或ADCP
• 尽管 extensive efforts，未能解析PC-1与瓜氨酸化波形蛋白结合的结构，可能与抗原的构象灵活性有关
• 尽管有这些局限性，发现支持肿瘤内BCR repertoire作为具有治疗潜力抗体的丰富来源

方法部分

6.1 Key Resources Table（关键资源表）

• 人类样本：PBMCs、血浆、卵巢癌单细胞悬液、NSCLC胸腔积液
• 化学品、肽和重组蛋白：链霉亲和素-HRP、CellMask、DAPI、重组波形蛋白、瓜氨酸化波形蛋白、p53、calreticulin、HSP90α、PAD2等
• 关键商业 assay：重组mAb生产、人类蛋白微阵列、肿瘤解离试剂盒、CCP ELISA、ANA kit等
• 软件和算法：ImageJ、CellRanger、Seurat、Harmony、Azimuth、scRepertoire、Clonalyst、Change-O、IgBlast、Alakazam、Shazam、FlowJo、GraphPad Prism、BiaControl/BiaEvaluation、HKL2000、PHENIX、AbEpiTope-1.0、AlphaFold3

6.2 Experimental Model and Study Participants（实验模型和研究参与者）

人类样本：

• TOP1501临床试验（NCT02818920）：单臂、三中心II期试验，35例IB、II、IIIA期NSCLC患者接受新辅助 pembrolizumab
• 患者接受2周期200mg静脉 pembrolizumab 后手术
• IRB# Pro00071629批准，知情同意
• 正常组织微阵列（CHTN_Norm3）购自Mid-Atlantic Cooperative Tissue Network

小鼠模型：

• NSG小鼠和B6小鼠（Jackson Laboratory）
• IACUC protocol# A011-23-01
• 每实验至少3个重复，数据来自至少2个实验、6只小鼠

细胞系：

• 人类：Calu-6、A549、H1703、A427（NSCLC）、OvCar3（卵巢）、Hec1a（子宫）
• 鼠：KPM（肺癌）、UPK10（卵巢癌）
• Phoenix-AMPHO、293T、Exp293F

6.3 Method Details（方法细节）

• 肿瘤样本收集和处理： Miltenyi Biotec人类肿瘤解离试剂盒，GentleMACs设备
• CODEX多重成像： 验证的CODEX抗体面板，循环剥离、退火、成像
• 转录组数据生成： CD138或CD19 MicroBeads磁标记，10x Chromium Single-cell 5'和V(D)J文库构建
• 重组抗体生产： GenScript TurboCHO转染 pipeline，Protein-A纯化
• ELISA： 纯化蛋白包被，抗体 serial dilution，HRP检测
• 免疫荧光染色： Calu-6或A549细胞，Alexa Fluor 488标记抗人IgG
• 共聚焦显微镜和图像分析： Leica SP5或SP8，40x油镜
• 结构研究蛋白表达： p53、CALR结构域、PC-1 Fab在E. coli或哺乳动物细胞中表达
• 蛋白纯化： HisTrap、Superdex 200、Talon cobalt、HiTrap Nickel等
• 表面等离子共振： Biacore T-200，CM5芯片，抗人IgG捕获
• X射线晶体学： 蒸汽扩散法，HKL2000处理，PHENIX分子置换，Coot手动精修
• 活细胞流式细胞术： 抗体5μg/mL，4°C 20min
• Western blot： RIPA裂解，4-20%凝胶，Li-Cor Odyssey成像
• 免疫沉淀： Dynabeads抗体偶联试剂盒
• 质谱： NuPAGE Bis-Tris，Waters MClass UPLC，ThermoFisher Fusion Lumos
• 瓜氨酸化重组蛋白： 重组人PAD2，50mM Tris-HCl pH7.5，10mM CaCl2，5mM DTT
• 环状瓜氨酸化肽ELISA： Immunoscan CCPlus test kit
• 核抗原抗体反应性： AtheNA Multi-Lyte ANA kit
• HuProt微阵列： 23,004种全长人类蛋白，1μg/mL PC-1 mAb
• 免疫组化： Roche Discovery Ultra，pH8.0 EDTA抗原修复
• CAR T构建体和转导： 逆转录病毒颗粒，Phoenix-AMPHO细胞，Lipofectamine 3000
• 细胞毒性 assay： xCELLigence系统，实时监测
• 鼠肿瘤模型： flank 肿瘤（Calu-6、A427），腹腔肿瘤（UPK10）
• FACS： DAPI viability dye，BD FACS ARIA
• CRISPR和PAD2⁻/⁻细胞系生成： tracrRNA:crRNA复合物，Neon NxT电转

6.4 Quantification and Statistical Analysis（定量和统计分析）

• TLS邻域聚类和斑块 delineation： 4个区域，30个空间邻域簇，密度-based层次聚类
• TLS成熟度分类： B细胞富集（<40%未成熟，≥40%成熟），Ki67表达（<10%静息，≥10%增殖）
• 单细胞RNA-seq数据收集、QC、整合和注释： CellRanger V5/V7，Seurat 5.1.0，Harmony，Azimuth
• BCR repertoire分析： Cell Ranger VDJ pipeline，scRepertoire，Clonalyst，Change-O，IgBlast，Alakazam，Shazam
• 基因集分析： Seurat AddModuleScore，pheatmap
• 表位模型预测： AlphaFold3，AbEpiTope-1.0，AbEpiScore-1.0，AbEpiTarget-1.0
• 统计分析： GraphPad Prism v10，Kaplan-Meier，log-rank，two-way repeated measures ANOVA，Sidak's multiple comparisons test

总体结论

研究通过单细胞BCR挖掘，从PD-1阻断治疗的NSCLC患者肿瘤浸润浆细胞中发现了肿瘤特异性抗体。领先抗体PC-1识别瓜氨酸化波形蛋白等抗原，这些抗原在肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞表面表达。PC-1 CAR T细胞在体外和体内均显示抗肿瘤活性，且无脱靶毒性。研究证明了内源性肿瘤体液免疫可被挖掘用于发现抗体靶点和开发下一代免疫疗法，为CAR T细胞治疗实体瘤提供了新的思路。

生活很好，有你更好