文献分享--γδ T细胞调节小细胞肺癌的抗肿瘤免疫

作者，Evil Genius

国庆假期马上结束了，大家做好搬砖的准备了么？

今日我们分享文献

Graphical Abstract

Infiltration of γδ T cells in SCLC（γδ T细胞在SCLC中的浸润）：

• 非受累淋巴结（Non-affected lymph node）：γδ T细胞低细胞毒性潜力
• SCLC受累淋巴结（SCLC-affected lymph node）：γδ T细胞高细胞毒性潜力，浸润免疫细胞

Redirected- and sensitised-killing of Vδ2⁺ γδ T cells（Vδ2⁺ γδ T细胞的重定向和敏化杀伤）：

• Tarlatamab（DLL3-CD3 BiTE）通过CD3和TCR重定向Vδ2⁺细胞
• BTN2A1/BTN3A1与Vδ2⁺ TCR结合
• Zoledronate敏化SCLC细胞

Better outcomes associated with γδ T cells & ICB（γδ T细胞与ICB相关的更好结局）：

• n=382 SCLC患者
• γδ T高 + αPD-L1组总生存概率优于γδ T低 + αPD-L1组

Autologous and allogenic co-culture with Vδ2⁺ γδ T cells（与Vδ2⁺ γδ T细胞的自体和异体共培养）：

• SCLC受累淋巴结、PBMC、离体SCLC扩增、离体Vδ2⁺扩增
• 共培养验证杀伤效果

简介

γδ T细胞浸润SCLC并具有抗癌能力。这些细胞可以通过多种治疗手段被利用来杀伤SCLC，包括通过BTN2A1的MHC非依赖性识别机制。值得注意的是，γδ T细胞浸润在SCLC中具有临床相关性，高浸润预测αPD-L1治疗后的改善结局。

亮点

1. γδ T细胞浸润预测αPD-L1治疗后SCLC患者更好的结局
2. γδ T细胞在tarlatamab（DLL3-CD3 BiTE）重定向的SCLC杀伤中有效
3. Zoledronate敏化SCLC细胞对Vδ2⁺细胞介导的杀伤
4. BTN2A1是Vδ2⁺细胞识别和杀伤SCLC所必需的，独立于MHC-I

摘要

背景： 小细胞肺癌（SCLC）是一种高度侵袭性肿瘤，对抗PD-(L)1阻断的敏感性有限，这可能是由于MHC-I的表观遗传沉默所致。因此，阐明MHC-I非依赖性的免疫识别机制对于增强治疗反应和改善更多患者的临床结局至关重要。

方法： 利用单细胞方法，研究发现了SCLC患者生物标本中的γδ T细胞浸润。

主要发现：

1. 尽管表达PD-1，γδ T细胞仍维持细胞毒性转录谱，表明其具有抗肿瘤作用
2. 两项改变临床实践的临床试验中，高γδ T细胞浸润预测SCLC患者对anti-PD-L1免疫治疗的改善反应
3. 使用临床前模型证明，γδ T细胞在tarlatamab（DLL3-CD3 BiTE）重定向的SCLC杀伤中有效
4. Zoledronate（FDA批准化合物）可敏化SCLC细胞对γδ T细胞介导的杀伤

结论： 研究结果表明，被激活的γδ T细胞是SCLC治疗的潜在有价值靶点。

引言

SCLC的临床挑战：

• SCLC是肺癌的侵袭性亚型，大多数患者表现为广泛期（ES）疾病
• 诊断和分期通常通过支气管内超声引导下经支气管针吸（EBUS-TBNA）取样病理胸部淋巴结（LNs）
• 全身治疗：铂类化疗联合抗PD-L1（atezolizumab、durvalumab）免疫治疗是ES疾病一线标准治疗
• 尽管如此，SCLC患者对免疫治疗的持久反应比例仍然很低
• 可能原因：对驱动免疫逃逸的关键机制理解不完全
• 几个因素：
  • SCLC中MHC-I的表观遗传沉默
  • CD8⁺ T细胞浸润的可变性
  • SCLC肿瘤细胞表面PD-L1表达的缺失
• 这表明适应性免疫系统（特别是CD8⁺ T细胞）在根除SCLC肿瘤细胞方面存在缺陷

BiTEs作为替代策略：

• 双特异性T细胞衔接器（BiTEs）正在迅速成为有效的免疫治疗特异性方法
• 以MHC-I非依赖的方式促进细胞毒性T细胞重定向到肿瘤
• Tarlatamab：靶向SCLC肿瘤细胞表面的DLL3和T细胞上的CD3
• 2024年5月获得FDA加速批准，基于在预治疗ES-SCLC患者中显著的客观反应和总生存率
• 在临床前SCLC模型中观察到常规CD8⁺和CD4⁺ T细胞激活和增强的肿瘤浸润
• 但γδ T细胞群体在tarlatamab抗肿瘤活性中的贡献仍未被探索

γδ T细胞的特征：

• 先天样T细胞群体
• 与常规αβ T细胞不同，可以独立于MHC分子上的抗原呈递进行免疫监视
• 使用T细胞受体（TCRs）或自然杀伤（NK）细胞受体识别转化细胞上的应激诱导配体
• 越来越被探索用于癌症免疫治疗
• 被认为是抗肿瘤免疫的特别有吸引力的靶点，因为：
  • 定位于上皮屏障部位，如肺部
  • 对功能性耗竭的易感性降低
• γδ T细胞已被认为是与免疫检查点阻断（ICB）协同作用的效应群体，特别是在MHC-I表达功能障碍的上皮癌中
• γδ T细胞的存在和频率与非小细胞肺癌（NSCLC）和25种实体癌的预后相关

研究目的：

• 使用scRNA-seq和免疫表型分析全面分析SCLC患者生物标本中的免疫细胞景观扰动
• 通过检查癌症受累和非受累样本，鉴定出具有有效抗肿瘤免疫特征的肿瘤内γδ T细胞群体
• 使用临床前模型验证
• 支持利用γδ T细胞的 emerging therapies 在SCLC治疗中的临床效用

结果一、SCLC活检样本中的γδ T细胞显示细胞毒性特征

方法：

• 对SCLC患者肿瘤生物标本进行scRNA-seq（n=11 EBUS-TBNA生物标本；n=1组织切除）
• 酶解消化样本通过流式细胞术富集免疫（CD45+）和肿瘤（EpCAM+）细胞
• 单细胞分选到384孔板，使用CEL-Seq2进行scRNA-seq分析
• 某些患者通过排除成纤维细胞和基质细胞（CD31-CD140b-CD235a）富集免疫和肿瘤细胞
• 总计13,002个单细胞通过质量控制，每个患者贡献498至1,537个细胞
• 整合和批次校正后，UMAP可视化显示免疫和肿瘤细胞之间的清晰分离

免疫细胞聚类：

• 免疫细胞分离、批次校正和重新聚类，产生20个cluster
• 使用已发表的健康个体和SCLC患者scRNA-seq基因签名注释免疫细胞
• 鉴定出关键细胞毒性亚群：γδ T细胞（clusters 6和7）、CD8+ T细胞（cluster 10）、NK细胞（cluster 9）
• 由于γδ T细胞显示与CD8+ T和NK细胞的转录相似性，为验证clusters 6和7为真正的γδ T细胞：
  • 对来自两名SCLC患者（SCLC13和SCLC14）的非受累LN（N-LN）和SCLC受累LN（S-LN）活检的FACS分选Vδ2+和Vδ2- γδ T细胞进行scRNA-seq（n=450细胞）
  • 使用已发表的γδ T细胞签名确认clusters 6和7表达更高水平的γδ T细胞相关基因
  • 基因集测试显示clusters 6和7中γδ T细胞评分统计学显著富集
• 尽管S-LN和原发肺肿瘤之间存在一些解剖部位依赖的免疫细胞组成偏差（特别是在B细胞 compartment），γδ T细胞在两个解剖部位均被观察到，并在所有12例患者样本中可见
• 免疫组化（IHC）染色确认所有患者匹配的诊断 blocks 中存在γδ T细胞

细胞毒性转录程序：

• 比较注释免疫细胞亚群中 canonical 细胞毒性基因的表达
• γδ T细胞群显示高水平的细胞毒性介质转录本，在其他SCLC scRNA-seq数据集中也可见
• 从S-LN样本分离的γδ T细胞显示比N-LN标本更高的细胞毒性基因表达
• 这些发现提供了SCLC中浸润性γδ T细胞显示细胞毒性特征的首次报告

结果二、高γδ T细胞频率预测SCLC患者对anti-PD-L1免疫治疗的OS获益

scRNA-seq队列分析：

• 将γδ T细胞频率与临床结局相关联
• 观察到患者活检样本中γδ T细胞频率与更长OS之间的显著相关性
• 相比之下，NK细胞和CD8+ T细胞频率与生存之间未见趋势
• 患者SCLC01显示最高频率的γδ T细胞（63%）并表现出长期生存（>80个月）
• 该患者在接受atezolizumab联合化疗前采集的重复组织活检（T4）显示肿瘤边缘γδ T细胞频率更高，表明这些细胞在肿瘤控制中的潜在作用

MHC-I表达分析：

• 相对于另一个原发肿瘤SCLC样本（SCLC02），患者SCLC01的原发肿瘤活检显示HLA-A、-B、-C的低细胞表面表达
• 显示HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M的最低转录表达
• 在S-LN样本的肿瘤细胞中比较表达水平时也观察到类似趋势
• 患者SCLC01诊断时（T0）和治疗期间（T1和T2）的系列外周血样本显示高γδ T细胞频率（T0：60%；T1：57%；T2：47%），显著超过其他SCLC患者（n=17，0.2%-30%）和健康供体（5%）
• 这表明患者SCLC01中循环和原发肿瘤部位的高频率γδ T细胞可能有助于观察到的延长生存

IMpower133临床试验分析：

• 分析n=271 ES-SCLC患者的bulk transcriptome数据
• Atezolizumab（anti-PD-L1）联合铂类化疗（卡铂/依托泊苷；EP）显示改善OS和PFS
• 使用δ TCR链TRDC的mRNA表达作为γδ T细胞浸润的代理
• TRDChigh患者在atezolizumab + EP后趋向更长OS（15.4个月）， compared with 同一治疗组TRDClow患者（10.8个月）
• 类似地，atezolizumab + EP治疗的TRGC2high（编码γ TCR链）患者趋向改善OS（14.4个月；HR=0.82，95% CI：0.50-1.3）， compared with 同一治疗组TRGC2low肿瘤（10.8个月）

CASPIAN 3期临床试验验证：

• ES-SCLC患者TRGC2high在durvalumab（anti-PD-L1）+ EP后趋向更长OS（12.7个月；HR=0.73，95% CI：0.42-1.3）， compared with 同一治疗组TRGC2low患者（8.6个月）
• 值得注意的是，在未接受ICB的局限期SCLC患者中，TRDChigh表达与有利OS之间无显著关联，表明TRDC表达单独不太可能作为SCLC的一般预后生物标志物

SCLC分子亚型分析：

• 先前对IMpower133试验患者的SCLC转录组分析表明，"inflamed"分子亚型（SCLC-I）肿瘤（以T细胞富集基因签名为特征）似乎更可能从免疫治疗中获益
• 研究能够在队列中解析许多非SCLC-I分子亚型的γδ T频率
• SCLC-I签名缺乏γδ T细胞相关基因（如TRDC和TRGC2）
• 由于CD8在蛋白质和转录水平上的共享表达，从γδ T细胞中解卷积CD8+ T细胞具有内在挑战性
• 实际上，在IMpower133和CASPIAN数据集中，51.5%和70.9%的CD8Ahigh肿瘤也被分类为TRDChigh和TRGC2high
• 因此，不能排除γδ T细胞对基于CD8Ahigh转录表达分层患者时观察到的改善生存率的影响
• 值得注意的是，HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M表达在TRDChigh; CD8Alow肿瘤中显著更低

结果三、SCLC活检中γδ T细胞的表征

流式细胞术分析：

• 评估N-LN和S-LN采样部位以及健康成人供体的免疫细胞计数与组织驻留和激活/耗竭标志物
• 配对点图显示N-LN和S-LN中γδ T、αβ CD8+ T和αβ CD4+ T细胞占CD3+ T细胞的百分比
• γδ T细胞在S-LN中显著增加（*p<0.05）
• CD8+ T细胞在S-LN中显著增加（*p<0.05）
• CD4+ T细胞在S-LN中显著增加（*p<0.05）

CD103表达：

• 代表性流式细胞术图显示患者SCLC13中N-LN（蓝色）和S-LN（红色）采样部位Vδ2+、Vδ2-和αβ CD8+ T细胞上的CD103表达
• CD103+细胞占总Vδ2+、Vδ2-和αβ CD8+ T细胞的百分比的量化
• Vδ2-和CD8+ T细胞在S-LN中CD103+显著增加（**p<0.01）
• Vδ2+细胞无显著差异（ns）

PD-1表达：

• 代表性流式细胞术图显示患者SCLC13中N-LN（蓝色）和S-LN（红色）采样部位Vδ2+、Vδ2-和αβ CD8+ T细胞上的PD1表达
• PD1+细胞占总Vδ2+、Vδ2-和CD8+ T细胞的百分比的量化
• Vδ2+细胞在S-LN中PD1+显著增加（*p<0.05）
• CD8+ T细胞在S-LN中PD1+显著增加（**p<0.01）
• Vδ2-细胞无显著差异（ns）

结果4、Vδ2+细胞在tarlatamab介导的SCLC细胞杀伤中与CD8+ T细胞一样有效

实验工作流程：

• 使用扩增的Vδ2+和αβ CD8+ T细胞与人类SCLC细胞系共培养±tarlatamab
• 通过活细胞成像（Incucyte）监测肿瘤细胞杀伤
• Tarlatamab作用机制：靶向SCLC肿瘤细胞表面的DLL3和T细胞上的CD3

DLL3表达：

• SCLC细胞系DLL3表达热图：
  • SHP77：24.2（高）
  • H146：24.2（高）
  • DMS273：18.2（高）
  • H82：8.2（中）
  • H524：3.2（低）
  • H526：3.0（低）
  • H211：2.1（低）
  • H460：1.2（低，DLL3阴性NSCLC）

杀伤实验：

• 与DLL3high水平一致，在tarlatamab存在下，SHP77细胞与Vδ2+细胞或CD8+ T细胞共培养时观察到显著杀伤
• DLL3阴性H460细胞未见杀伤
• 癌细胞死亡在加入tarlatamab后24小时量化，因为这始终代表活细胞成像量化的最大死细胞面积
• 在所有细胞系中，1,000至100 pM tarlatamab之间未见剂量依赖性杀伤，除了DMS273
• 因此，后续所有实验在生理相关剂量1,000 pM下量化癌细胞杀伤

SCLC亚型杀伤：

• Tarlatamab促进Vδ2+细胞对多种SCLC亚型的癌细胞杀伤
• SCLC细胞系H211、H146和H82是例外，其中观察到Vδ2+细胞的自发杀伤独立于tarlatamab
• Vδ2+和CD8+ T细胞之间的癌细胞杀伤程度相当，并与DLL3表面表达相关
• 值得注意的是，SCLC-P H211细胞系对tarlatamab介导的杀伤表现出最高敏感性（Vδ2+和CD8+ T细胞），尽管DLL3表面表达低

细胞因子产生：

• Tarlatamab介导的反应导致促炎细胞因子产生
• IFN-γ、TNF、GM-CSF和IL-13分泌在Vδ2+和CD8+ T细胞之间相当

组织相关表型：

• Vδ2+细胞具有显著更高比例的CD103+和PD-1+/CD103+细胞， compared with CD8+ T细胞
• 表明Vδ2+细胞中更高的组织相关表型

增殖和细胞毒性：

• Vδ2+细胞经历多轮增殖
• 在tarlatamab存在下与SCLC细胞共培养72小时后，细胞内GZMB显著增加
• 同时保持活力
• 这些数据表明tarlatamab可以有效接合Vδ2+细胞介导SCLC细胞杀伤，从而突出其作为CD3靶向免疫治疗效应细胞的潜力

结果5、Zoledronate促进自发性γδ T细胞介导的杀伤

背景：

• 观察到一部分SCLC细胞的自发杀伤
• 研究试图研究Vδ2+细胞独立于tarlatamab靶向检测和杀伤SCLC的相互作用机制
• 假设可能通过其TCR或NK细胞受体（如NKG2D）介导

NKG2D分析：

• 在S-LN样本中，Vδ2+细胞显示升高的NKG2D表面表达
• 然而，NKG2D配体MICA/B在scRNA-seq队列的SCLC肿瘤细胞中低表达
• 在显示Vδ2+细胞自发杀伤的SCLC细胞系中缺失
• 与此一致，成功阻断NKG2D未能抑制Vδ2+细胞杀伤SCLC细胞的能力
• 表明在系统中杀伤独立于NKG2D接合发生

BTN2A1/BTN3A1分析：

• 探索Vδ2+细胞是否可以通过TCR与BTN2A1/BTN3A1异二聚体在"开放"构象下接合识别转化细胞，由细胞内磷酸抗原（pAg）积累驱动
• 观察到高BTN2A1（而非BTN3A1）与自发Vδ2+杀伤之间的相关性，表明偏向于TCR与BTN2A1接合
• 甲羟戊酸途径是细胞内pAg的关键来源
• 通过使用FDA批准的药物如simvastatin和zoledronate扰动甲羟戊酸途径中的关键酶（HMGCR和FDPS）来间接调节BTN2A1/BTN3A1构象

Simvastatin实验：

• Simvastatin抑制HMGCR，从而阻止pAg积累
• 测试simvastatin治疗是否会减弱自发杀伤
• H211、H82和H146 SCLC细胞的simvastatin治疗降低了它们对来自两个独立供体的Vδ2+细胞自发杀伤的易感性

Zoledronate实验：

• 用zoledronate抑制FDPS，驱动pAg积累
• 不仅增强了具有自发杀伤易感性的SCLC系（H211、H82和H146）的杀伤
• 还敏化了先前难治的细胞系（SHP77和DMS273）
• 与这些观察一致，zoledronate增加了Vδ2+细胞的激活，通过CD103上调测量

BTN2A1敲除验证：

• 使用CRISPR-RNP技术在Vδ2+响应性SCLC细胞系中敲除BTN2A1
• SCLC细胞中BTN2A1敲除（KO）减弱了Vδ2+细胞在无zoledronate和有zoledronate时的反应能力
• 这些结果证明Vδ2+细胞对SCLC细胞的反应性依赖于系统中的Vδ2+ TCR-BTN2A1相互作用

临床相关性：

• 假设高BTN2A1表达的SCLC患者可能从PD-L1/PD-1轴的去抑制中获得更大获益
• IMpower133数据集分析显示高BTN2A1表达与atezolizumab + EP治疗后SCLC患者改善OS之间的显著关联（14.4个月）， compared with 其他组（9.7-10.4个月；HR=0.67，95% CI：0.45-0.99）
• 在CASPIAN临床研究中验证，高BTN2A1肿瘤的ES-SCLC患者在durvalumab + EP后获得最大OS获益（12.7个月）
• 结果表明高BTN2A1可能作为Vδ2+细胞利用以在SCLC中引发抗肿瘤反应的治疗轴

结果6、Zoledronate和tarlatamab在自体模型中促进γδ T细胞介导的SCLC杀伤

患者来源模型：

• 利用现有协议从外周血单核细胞（PBMCs）同时扩增Vδ2+细胞，并从新鲜分离的诊断EBUS-TBNA LN样本生成肿瘤类器官
• SCLC肿瘤类器官生长为松散聚集体，随时间形成漂浮球体，保留SCLC的形态和表型特征
• 自体Vδ2+细胞从患者SCLC15 PBMCs中用zoledronate和IL-2扩增，13天内Vδ2+细胞增加约260倍（0.15%-38.5%）
• 从另外两名SCLC患者扩增Vδ2+细胞，分别增加约86倍（0.096%-8.35%）至约58倍（1.54%-88.8%）

自体共培养：

• 肿瘤类器官与来自同一患者（SCLC15）的Vδ2+富集PBMCs体外暴露，在zoledronate或tarlatamab存在下显示增强的肿瘤细胞杀伤， compared with 载体处理的对照类器官
• 评估Vδ2+富集PBMCs中哪些T细胞亚群介导这种抗肿瘤效应
• 与肿瘤类器官共培养72小时后，分析Vδ2+和CD8+ T细胞上的PD-1和CD103表达
• Tarlatamab治疗后，Vδ2+（5.25%增至9.09%）和CD8+ T细胞（0.45%增至4.47%）中PD-1+CD103双阳性群体增加
• Zoledronate治疗后，PD-1+CD103双阳性群体的增加仅在Vδ2+细胞中检测到（10.9%增至21.6%）

异体验证：

• 在异体设置（n=2 SCLC患者）中使用从两名健康供体外周血分离的Vδ2+细胞验证这些发现
• 进一步支持Vδ2+细胞在SCLC中的关键抗肿瘤治疗潜力

讨论

SCLC治疗现状与挑战：

• 尽管是当前标准治疗，SCLC患者对anti-PD-(L)1免疫治疗的持久反应仍然很低
• 因此，替代免疫治疗方法能够引发增强反应和预测生物标志物的发现将对患者具有变革性
• γδ T细胞是一个新兴的免疫治疗靶点，因其在具有抗原呈递途径（表观）遗传改变的肿瘤中的抗癌效果而迅速获得关注

主要发现：

• 提供γδ T细胞靶向SCLC肿瘤关联的见解
• 揭示其在肿瘤微环境中独特的组织相关和效应表型
• 通过利用FDA批准疗法在SCLC临床前和患者来源模型中的γδ T细胞强效抗癌活性，提供证据表明γδ T细胞可能是SCLC患者中被低估但有前途的免疫治疗靶点

SCLC-I分子亚型与γδ T细胞：

• 当前识别对ICB免疫治疗反应的SCLC患者的框架（尽管是回顾性的）依赖于T细胞和抗原呈递基因签名，这些患者被认为是免疫"inflamed"（SCLC-I）
• 虽然这些签名富集CD8+ T细胞，但它们显著排除了γδ T相关基因（即TRDC和TRGC2）
• 使用两个临床数据集（IMpower133和CASPIAN），显示基于高γδ T相关基因分层的SCLC患者接受atezolizumab治疗后显示与SCLC-I患者相当的改善结局
• 此外，发现γδ T细胞也存在于其他SCLC分子亚型（即SCLC-A、-N和-P）中，这些通常MHC-I低且非免疫性inflamed
• 证明肿瘤微环境中的γδ T细胞显示组织相关特征并维持细胞毒性效应功能，尽管表达PD-1， unlike αβ CD8+ T细胞，其中PD-1通常标记耗竭
• 表明γδ T细胞可能在PD-(L)1阻断下保留效应功能，特别是在MHC-I低肿瘤中
• 与NSCLC、结肠癌和Merkel细胞癌中的先前证据一致
• 发现表明γδ T细胞是SCLC中具有治疗相关性的被低估免疫群体，γδ T细胞可能作为MHC-I低分子亚型中ICB反应性的预测生物标志物
• 正在进行中的SWOG2409-PRISM临床试验（NCT06769126）旨在采取亚型-生物标志物导向的治疗方法，强调了准确基因 curation 对识别SCLC-I亚型的重要性
• 因此，研究支持将γδ T细胞相关基因纳入以识别更广泛的可能从ICB免疫治疗中获益的SCLC患者队列

Tarlatamab与γδ T细胞：

• Tarlatamab因其将CD3+ T细胞重定向到癌细胞独立于MHC-I接合的能力而革新了SCLC患者反应
• 然而，先前的报告缺乏关于tarlatamab是否有效重定向γδ T细胞的 granularity
• 本研究表明Vδ2+细胞（最常见的循环γδ T细胞亚群）在SCLC癌症杀伤中与αβ CD8+ T细胞一样有效，表明Vδ2+细胞可能是tarlatamab治疗后的强效效应细胞
• 此外，显示有效重定向发生在 irrespective of SCLC分子亚型，表明高DLL3表达（先前显示仅限于SCLC-A和SCLC-N亚型）不是tarlatamab反应的预测生物标志物

循环Vδ2+ γδ T细胞的临床效用：

• 支持靶向循环Vδ2+ γδ T细胞的效用
• 双特异性γδ T细胞衔接器（如LAVA-051和LAVA-1207）的临床试验已将较高的基线Vδ2+频率与延长的治疗反应联系起来
• 升高的Vδ2+水平与非小细胞肺癌的良好预后相关
• 虽然与长期生存SCLC患者相关的生物学特征 largely unknown，但发现患者SCLC01（具有令人印象深刻的OS，诊断后≥6年）循环和SCLC组织样本中异常高的γδ T细胞数量，可能表明γδ T细胞在肿瘤控制中的关键作用
• 因此，需要更大的患者队列来确定循环Vδ2+水平是否可作为预后生物标志物
• 此外，数据支持进一步研究γδ T细胞过继转移方法在SCLC中的临床效用

Zoledronate与tarlatamab的互补策略：

• Tarlatamab依赖双特异性靶向来接合CD3+ T细胞
• 数据表明zoledronate通过不同机制起作用，既扩增又敏化Vδ2+细胞对SCLC细胞， irrespective of 分子亚型
• 这些互补策略突出了SCLC中γδ T细胞 based approaches 的未开发治疗潜力
• 考虑到化疗耐药SCLC中甲羟戊酸途径的依赖性增加，这与增加的pAg相关
• 虽然zoledronate目前用于治疗骨质疏松症和溶骨性癌症，但它与乳腺癌的无病生存改善、NSCLC骨转移患者的OS改善以及NSCLC和SCLC中骨骼相关事件的减少相关
• 然而，zoledronate对SCLC中OS的具体影响仍不清楚
• 鉴于高达25%的SCLC患者诊断时出现骨转移，发现强调需要研究其对SCLC患者结局的更广泛影响
• 值得注意的是，新兴的靶向递送策略，包括DLL3导向的抗体-药物偶联物，可能有助于克服zoledronate的骨趋向性和脱靶摄取，为增强SCLC中γδ2+介导的抗肿瘤活性提供有前途的途径

结论：

• 研究强调γδ T细胞存在于SCLC肿瘤微环境中，并准备发挥抗肿瘤活性，可以通过现有免疫疗法以及重新利用FDA批准药物如zoledronate来增强
• 特别是，Vδ2+细胞的独特特征可以规避与MHC-I低SCLC相关的挑战
• 此外， concerted effort refining biomarkers to identify an immune-inflamed group and patients who may benefit from adoptive transfer strategies could ultimately improve OS for a broader range of SCLC patients in the future

研究局限性

• 研究主要分析癌症受累LN活检样本，原发SCLC肿瘤代表性有限
• 尽管如此，鉴于γδ T细胞在肺部占据免疫 niche，发现表明γδ T细胞可能也浸润原发肿瘤
• 此外，虽然研究仅从约3,500个免疫细胞生成单细胞转录谱，但一致地在所有患者中鉴定出γδ T细胞群体，突出了CELseq2方法的潜在技术优势
• 此外，虽然共培养 assay 是证明Vδ2+细胞有效重定向到SCLC肿瘤和 interrogate 潜在机制的有力、还原论手段，但未在人源化小鼠模型中体内验证这种抗癌活性，不能排除Vδ2-细胞引发类似效应
• 实际上，在SCLC患者活检样本中也观察到Vδ2-细胞
• 因此，Vδ2+以外的其他γδ T细胞亚型的抗肿瘤活性值得进一步研究

方法

Key Resources Table（关键资源表）

• 抗体：用于流式细胞术和IHC的多种抗体（抗CD45、抗EpCAM、抗CD31、抗CD140b、抗CD235a、抗CD14、抗CD19、抗CD3、抗γδTCR、抗Vδ2、抗CD4、抗CD8、抗CD56、抗CD103、抗PD-1、抗NKG2D等）
• 细菌和病毒株：Incucyte Nuclight Red Lentivirus
• 生物样本：癌症受累LN活检样本、非受累LN活检样本、原发肿瘤活检样本、PBMCs、健康供体Vδ2+和CD8+ T细胞
• 化学品、肽和重组蛋白：Tarlatamab、DAPI、Y-27632、重组人IL-2、Zoledronic acid、Simvastatin、MICA-Tetramer
• 关键商业 assay：SYTOX Green、Zombie NIR、Live/dead fixable NIR、Human TruStain FcX、Human Fc Block、Bambanker、P3 Primary Cell 4D Nucleofector X Kit S
• deposited data：scRNA-seq of all immune cells from n=12 SCLC patients、scRNA-seq of γδ T cells from n=2 SCLC patients
• 实验模型：细胞系（SHP77、H146、DMS273、H82、H524、H526、H211、H460）、类器官（SCLC15、SCLC16）
• 寡核苷酸：sgRNA（BTN2A1null1、BTN2A1null2、Non-targeting control）、NGS primers
• 软件和算法：GraphPad Prism 10、R Studio、cBioportal、BioRender、Incucyte Live Cell Analysis System、FlowJo、Affinity Designer 2、scPipe、Rsubread、R、Bioconductor、Seurat、scater、scran、harmony、batchelor、CRISPR indel calculator v2

生活很好，有你更好。