文献分享（xenium）--人类成人和儿童从压力负荷到衰竭右心室进展的多模态转录组图谱

作者，Evil Genius

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太原这边就不说了，简直可以用鲁迅的话来讲---吃人。

给人感觉最不好的地方，没想到是自己的家乡。

今日我们分享文献

摘要总结

右心室衰竭（RVF）独立预测心力衰竭的死亡率，但其病理生理学知之甚少。本文提出了人类右心室压力负荷和衰竭的多模态图谱，包括成人（bulk RNA-seq n=142；snRNA-seq n=11；Xenium空间转录组 n=9）以及儿童（n=14）和小鼠肺动脉环缩（PAB）队列。

• 亚聚类在12个谱系中解析出34种细胞亚型，沿两阶段轨迹分布。
• 第一阶段（非衰竭→压力负荷）解释了bulk和snRNA-seq可检测的大部分转录变化，标志为驻留巨噬细胞身份丢失、成纤维细胞活化、内皮扩张和组织保护性程序侵蚀。
• 第二阶段（压力负荷→RVF）在bulk RNA-seq中变化很小，但通过空间转录组学解析，涉及多谱系纤维化、内皮活化和心肌细胞再激活程序，细胞外基质（胶原、层粘连蛋白、血小板反应蛋白）信号增加，而稳定的细胞接触粘附基线保持不变。
• 线粒体呼吸测定显示成人和小鼠RVF中存在呼吸功能障碍，但儿童RVF中没有。
• 心脏微环境的多谱系重塑成为RVF的核心分子程序，值得作为可能的疾病修饰靶点进一步研究。

Introduction

1. 右心室的独特性与RVF的临床重要性

• 正常右心室（RV）在形态学和胚胎学上不同于左心室（LV），因此不能将左侧病理生理学的理解直接外推到右心。
• 历史上，心脏研究集中于左心室衰竭（LVF），已产生多种获批疗法，而对RVF关注较少。
• 尽管RVF最常见的原因是LVF继发的压力过载，但RVF也可源于多种其他原因。
• 独立于病因，RV功能障碍预示不良预后：LVF伴RV功能障碍的患者死亡风险约增加两倍。

2. LVF疗法的局限与RVF特异性靶点的需求

• LVF治疗的进展由靶向关键通路（如肾素-血管紧张素-醛固酮系统，RAAS）驱动。
• 将这些疗法推广到RV的尝试在临床上未成功。神经激素阻断是LVF治疗的基石，但在RVF中几乎没有疗效。
• 因此，需要探索性研究来识别RVF特异性治疗靶点。

3. 研究目标

• 对衰竭和非衰竭人类RV进行多平台转录组研究，整合bulk RNA-seq（142例）、snRNA-seq（11例）和Xenium空间转录组学（9个切片），并结合线粒体呼吸测定、流式细胞术和组织学验证。
• 将这些发现置于更广泛的背景中，与小鼠肺动脉环缩（PAB）模型、儿童单心室RV、LVF和已发表的肺动脉高压（PAH）RV转录组数据集进行比较。
• 提出两阶段模型：在LVF背景下从非衰竭（NF）到保留RV（pRV）的转变过程中，多种细胞类型发生多谱系保护性程序侵蚀；随后是pRV→RVF转变，在bulk RNA表达变化中相对 muted，但在Xenium空间伪bulk分析中涉及更广泛的多谱系信号。

结果

结果1、队列和多平台方法

样本来源：

• 从Penn Human Heart Tissue Bank收集成人NF器官供体和LVF移植受者的透壁RV样本，后者再分层为压力负荷但收缩功能保留（pRV）和衰竭（RVF）组。

多平台分析：

• Bulk RNA-seq（n=142）
• snRNA-seq（n=11；61,398个细胞核）
• Xenium空间转录组学（n=9个切片；625,305个细胞；477基因面板）
• 小鼠PAB模型（2周和2个月时间点）
• 儿童snRNA-seq队列（n=14；10例左心发育不良综合征（HLHS）姑息RV按功能正常或RVF分层，4例对照）
• 与已发表PAH RVF bulk数据集的跨病因比较

结果2、Bulk RNA-seq揭示RV衰竭进展的转录组图谱

PCA分析：

• Bulk RNA-seq的PCA将NF与pRV/RVF分开，但pRV与RVF分离不佳。

差异表达（DE）：

• NF vs pRV/RVF产生许多DEGs，NF→pRV和NF→RVF的fold change（FC）高度相关。
• pRV和RVF共同的显著DEGs包括心脏应激（NPPA、NPPB）、趋化因子（CXCL8-11）和ECM/血管生成基因。
• 通路富集突出免疫、补体和炎症术语，提示免疫群体主导bulk信号。
• 许多DEGs呈现从NF→pRV→RVF的逐步变化：115个逐步增加基因富集T细胞趋化，161个逐步减少基因富集线粒体核糖体组分。
• pRV→RVF分析中显著DEGs较少，表明大多数转录重塑先于功能失代偿。
• pRV上调基因富集氧化磷酸化（OXPHOS）；RVF上调基因以免疫为主。

WGCNA分析：

• 解析29个基因模块，几乎所有模块在状态间差异表达。
• 两个OXPHOS模块（M25和M26）在模块eigengene水平沿NF→pRV→RVF单调下降。
• 大型驻留巨噬细胞模块M1（CD163、MRC1、VSIG4）在NF中最高，从NF到pRV急剧下降后趋于平稳。
• 相反方向，适应性免疫模块（M8；T/B细胞和MHC-II基因）从NF到pRV显著上升。

跨病因比较：

• 与已发表PAH相关RVF转录组比较：RVF vs NF产生235个一致下调基因（呼吸电子传递链、复合物I生物发生）和214个一致上调基因（IFN α/β、抗病毒信号），确立线粒体下降和IFN激活为病因共享特征。
• 相反，补体级联在队列间存在分歧：在本RVF中下调，在PAH RVF中上调，识别补体激活为病因特异性反应。

结果3、单核转录组学在12个谱系中解析34种细胞亚型

细胞聚类：

• 11例RV样本的snRNA-seq产生61,398个细胞核（每个细胞核2,912个基因）和12个主要聚类。
• 细胞组成随疾病进展逐渐变化：从NF→pRV→RVF，心肌细胞核丢失，内皮细胞（EC）核扩张。
• 这一组成变化与LVF snRNA-seq图谱的报道平行，但值得注意的是，此处的非肌细胞扩张以内皮为主，而没有LVF典型的成纤维细胞扩张。

WGCNA模块与谱系：

• Bulk WGCNA模块被分配到主导谱系。
• snRNA-seq亚聚类在12个谱系中解析出34种亚型：10种心肌细胞、7种成纤维细胞、5种EC、6种髓系，以及6个在谱系水平保留的谱系（周细胞、平滑肌、脂肪细胞、心外膜、神经元/胶质和NK/T），因计数低。

差异表达响应性：

• 在每种亚型内进行伪bulk DESeq2跨三个成对比较。
• 成纤维细胞转录响应最强（pRV vs NF有1,083个DEGs；RVF vs NF有806个DEGs），其次是心肌细胞（248；464）。
• 这一差异部分反映了成纤维细胞患者间离散度较低。

结果4、空间转录组学扩展并验证单核发现

Xenium分析：

• 在10x Xenium上分析9个透壁RV切片（每例患者一个；625,305个细胞；477基因面板）。
• 对照snRNA-seq参考的注释产生一致的细胞类型分配。
• 伪bulk DESeq2在跨平台FC水平上广泛佐证了snRNA-seq，空间图确认所有切片的一致分配。
• 按面板大小标准化后，Xenium的第二阶段DEG检测率显著高于snRNA-seq（约18%面板显著 vs 约0.4%全基因组），与更高的Xenium细胞计数一致。

SpaGE插补与空间生态位：

• SpaGE插补使亚聚类超越477基因面板，在12个Xenium谱系中解析出58种Xenium亚型。
• 空间生态位分析产生14个生态位。
• 生态位丰度变化 modest，但受n=3每组统计功效限制：一个生态位达到名义显著性（应激心肌；pRV/RVF富集）。
• 六个额外生态位显示趋势：脂肪-血管、毛细血管丰富心肌、动脉和炎症脂肪基质生态位在RVF中富集，而致密心肌在pRV中最高，纤维化心肌在RVF中最低。
• 没有生态位在多重比较校正后存活，因此这些发现需要更大队列验证。

结果5、RV衰竭进展的两阶段轨迹

两阶段模型：

• 围绕两个阶段组织细胞类型结果：
  • 第一阶段（NF⇒pRV）：组织范围保护性程序侵蚀。
  • 第二阶段（pRV⇒RVF）：数量上变化较少，解析为局灶细胞类型特异性程序（心肌细胞氧化应激/BMP和EC EndoMT/血管生成活化），最好由空间转录组学捕获。
• 跨平台整合伪bulk DESeq2显示，所有三种assay中第一阶段>>第二阶段：NF⇒pRV产生2,509（bulk）/1,783（snRNA-seq）/88（Xenium）个独特符号谱系水平DEGs，而pRV⇒RVF为5/61/39。

第一阶段特征：

• 多谱系且跨平台一致。
• 非心肌细胞丢失与糖皮质激素受体（GR）反式激活相关的基因，特别是GR共伴侣FKBP5（在11/24非心肌细胞亚型中显著），以及经典GR靶点ZBTB16和KLF9。
• 心肌细胞显示α-肌球蛋白重链（MYH6）和核纤层相关基因MLIP下调，胎儿基因程序（NPPA、NPPB、ACTA1）在bulk组织水平重新激活。
• 更广泛地，心肌细胞协调下调核编码线粒体基因，涵盖脂肪酸氧化（FAO）、三羧酸（TCA）循环、OXPHOS亚基和线粒体核糖体，以及生物发生调节因子PGC-1α（PPARGCIA）和ERRα（ESRRA）。
• 在非心肌细胞谱系中，谷胱甘肽/硫氧还蛋白氧化还原缓冲基因（GCLC、GCLM、GSR、TXNRD1、SRXN1、SLC7A11）协调下调，分泌型谷胱甘肽过氧化物酶GPX3（与RVF有因果关联）也下调。
• 髓系池下调稳态受体（CD163、VSIG4；MERTK趋势），同时诱导常规树突状细胞标志物（CD83、CD1C和FCER1A）。
• 所有七种成纤维细胞亚型中TGFβ共受体TGFBR3下调，成纤维细胞活化（SFRP4、THBS4）。
• 在EC中，pRV已标志为稳态、抗氧化和血管保护程序的侵蚀——特别是IL-33受体IL1RL1/ST2和基质金属蛋白酶抑制剂TIMP3和TIMP4，反调节RAAS酶ACE2并行下降。
• snRNA-seq还揭示II型IFN反应（IFI44/IFI44L、MX1/MX2、OAS3、RSAD2、STAT1），Xenium面板无法解析，因为ISGs在面板外。
• 壁细胞增加早期失稳至共享的血管保护丢失。注意到结构基因ELN（弹性蛋白）和DES（结蛋白）、静息基质代谢酶ADH1B以及TIMP3、TIMP4、IL1RL1/ST2和ACE2下调，snRNA-seq增加SMAD3丢失。

第二阶段特征：

• 局灶且细胞类型特异性，而非平台驱动。
• 谱系水平显著基因：Xenium 39个，snRNA-seq 61个，bulk 5个（每个对比的独特基因符号），在可检测处跨平台方向一致。
• 信号集中在两个谱系：
  • 心肌细胞：Xenium揭示BMP/TGFβ超家族信号程序（BMPR2、BMPR1A、FSTL3、BAMBI上调）。受体及其抑制剂的同时上调是心肌细胞限制性的，与遗传性PAH的受体功能丧失相反。
  • EC：第二阶段解析为EndoMT/血管生成失稳程序（SNAI1、ADAMTS1、ANGPT2上调；snRNA-seq方向一致）。
• CCR2巨噬细胞重塑保持分级而非离散的第二阶段步骤。
• 模块水平分析解析两个跨平台一致程序：心肌细胞OXPHOS模块集（M10、M25、M26）逐渐下调，而髓系炎症、细胞因子和免疫球蛋白模块（M8、M13、M15）协调诱导。

结果6、空间约束的细胞-细胞通讯揭示阶段特异性信号

CellChat分析：

• 细胞-细胞通讯推断（CellChat，应用于Xenium衍生空间约束下的每患者snRNA插补Xenium表达）揭示沿NF→pRV→RVF轴心肌信号的进行性重组。
• 在每个条件下，最高概率通路是接触介导的粘附程序（PTPRM、NCAM、ADGRL、CDH），与心肌致密细胞堆积一致，作为稳定基线而非疾病特征。
• 在此基线上叠加，RVF显示ECM信号的选择性增加：COLLAGEN、LAMININ和THBS，在NF和pRV中排名靠前的相互作用中低或缺失，在RVF中特异性地升至突出位置。
• 这种基质信号增加与matrifibrocyte样成纤维细胞状态的出现一致，将成纤维细胞到基质通讯框定为RVF的定义特征。

结果7、心肌细胞在RV衰竭中显示线粒体功能障碍

心肌细胞亚型：

• snRNA-seq亚聚类解析出10种心肌细胞亚型，由不同功能基因程序定义，在NF与疾病状态之间表现出相反的比例变化，pRV/RVF之间Subcluster分布相似。
• SpaGE插补标签转移在单细胞空间分辨率上佐证亚型映射。
• 疾病RV中三种亚型扩张：CM BetaMHC（胎儿肌节）、CM HAND2（RV特异性HAND2和内皮受体EDNRA）和CM RORA，CM NPP（NPPA/NPPB）有扩张趋势。这代表胎儿、发育和牵张应激程序的重新激活。
• 并行地，生酮（CM HMGCS2；趋势）、MYH6基线（CM MYH6）和心房样（CM HTR4；趋势）亚型均在NF中富集，在pRV/RVF中丢失。
• HMGCS2在12/12 Xenium心肌细胞亚型中受抑制（pRV vs NF）。
• snRNA-seq还显示泛心肌细胞MYH6下调（7/7），MLIP丢失（2/7）和STAT2/ISG在三种亚型中诱导，表明心肌细胞内在先天免疫激活。

WGCNA与DESeq2分析：

• 心肌细胞WGCNA模块将NF与pRV/RVF分开。
• pRV/RVF升高的M2富集收缩/粘着斑和结构/ECM基因。
• M12包含TNNI3/TNNI3K（第一阶段bulk DEGs）以及BMPR2/MYH7（亚阈值）。
• M10/M25/M26（线粒体模块）在心肌细胞亚型和心肌细胞伪bulk DESeq2分析中抑制，显示核编码线粒体组分（如NDUF、SDHC、COX和ATP5亚基）适度（中位log2FC≈-0.22）但广泛一致的转录下调，不偏向任何单一复合物。
• 聚合MitoCarta3.0模块评分在心肌细胞Subcluster和疾病阶段中下降。
• 在线粒体生物发生调节因子中，ESRRA（ERRα）最为突出，跨模态一致抑制，转录本和推断调节活性在心肌细胞中降低，在bulk RV中显著抑制。
• PPARGCIA（PGC-1α）在心肌细胞转录本和活性水平均受抑制。
• PPARA显示推断活性降低，表达趋势一致但不显著。
• 对于NRF1和PPARD，推断活性和测量表达分歧。

线粒体呼吸测定：

• 分离RV线粒体的呼吸测定（Oroboros O2K）显示RVF中协调的ETC抑制，与先前文献一致：最大OXPHOS容量（复合物I+II）在pRV和RVF相对于NF类似下降（pRV -42%，RVF -40%），复合物II驱动呼吸并行损失约35-37%（Kruskal-Wallis显著）。
• 复合物I（-32%至-39%）和复合物IV（-22%至-28%）显示非显著下降趋势，非线粒体呼吸不变。
• 呼吸容量最大变化发生在NF⇒pRV，反映此阶段发生的主导线粒体转录变化。

心肌细胞肥大验证：

• WGA横截面积确认NF⇒pRV⇒RVF中心肌细胞进行性肥大（中位最小Feret直径55.8⇒73.9⇒102.5 μm）。
• Xenium将NPPA/NPPB诱导定位到心内膜边界。

结果8、成纤维细胞在RV衰竭早期活化

成纤维细胞亚型：

• 成纤维细胞是转录响应最强的snRNA-seq群体（pRV vs NF 1,083 DEGs；RVF vs NF 806 DEGs）。
• 亚聚类解析出7种文献支持的亚型：Fb Resident、Adventitial、Elastogenic、Interstitial、Stressed、Pro-fibrotic和Anti-fibrotic，成纤维细胞亚型比例在疾病状态间总体稳定。
• snRNA-seq轨迹前负载并与Xenium一致：在第一阶段，TGFβ共受体TGFBR3下调，连同GPX3和基质/弹性蛋白基因ELN和TIMP3。同时，经典肌成纤维细胞/基质细胞标志物THBS4和ACTA2以及活化成纤维细胞标志物SFRP4被诱导。

第二阶段成纤维细胞程序：

• 在谱系水平，snRNA-seq、bulk或面板过滤的Xenium数据均未产生RVF vs pRV的显著纤维化DEGs。
• Xenium成纤维细胞亚型分辨率暴露了局限于活化/基质细胞亚群的局灶第二阶段程序，涉及THBS4、TNC和PRG4（snRNA-seq方向一致，不显著）。
• 两个文献定义的模块评分锚定两阶段分裂：Koenig等人供体成纤维细胞身份特征在NF⇒pRV急剧崩溃，在失代偿时无进一步下降；而Fu等人matrifibrocyte承诺特征在NF⇒pRV平坦，仅在pRV⇒RVF趋势上升。
• 这表明成纤维细胞身份侵蚀是第一阶段特异性，而纤维化承诺是第二阶段特异性。
• 跨平台相似性对Stressed和Interstitial亚型最强。
• 空间邻域分析将FB Stressed、Matrix、Intermediate和CILP置于髓系富集生态位（Xen FB Matrix-髓系Pearson's r=0.93）。
• Masson三色/Sirius Red组织学确认进行性纤维化（每阶段+5.9%面积）。
• 在RVF中，纤维化心肌生态位占据较小切片面积比例。这不一定代表更少纤维化，因为生态位比例是组成性的。它们描述切片面积如何在邻域之间分配，而非每个邻域含有多少基质。上升的组织学胶原负荷、pRV⇒RVF ECM信号增加和matrifibrocyte承诺趋势均测量基质含量或成纤维细胞状态，与现有邻域内纤维化重塑加剧而应激心肌和血管生态位扩大其切片份额相容。
• 从先前LV研究识别的成纤维细胞Subcluster同样被恢复，表明心室间成纤维细胞生物学的保守性。

结果9、壁细胞在RV衰竭中丢失血管保护程序

壁细胞亚聚类：

• 壁细胞snRNA-seq亚聚类将周细胞与平滑肌分开。
• 周细胞经历第一阶段血管保护程序丢失，涵盖代谢、稳态、抗蛋白酶、抗炎和抗氧化功能，跨bulk、snRNA-seq和Xenium伪bulk一致。
• 丢失 largely 限于周细胞。周细胞snRNA-seq还显示TGFβ共受体TGFBR3和缺氧通路基因HIF3A下调。
• 通过 curated 伪bulk模块评分（TIMP3、IL1RL1、GPX3、ELN）量化保护程序丢失，其NF/pRV/RVF轨迹与成纤维细胞模块平行。
• 在谱系水平，壁细胞未显示显著第二阶段变化，而snRNA-seq伪bulk亚谱系分析揭示IEG/AP-1应激和部分收缩逆转作为主导基因分组。
• Xenium亚型分辨率解析局灶亚群限制性命中：Pericyte_KCNJ8、Pericyte_THBS4和VSMC_Inflamed中MYH11丢失；VSMC_Arterial中CNN1诱导；VSMC_Inflamed中NR4A3诱导（跨平台一致），支持局灶第二阶段程序而非泛壁细胞转变。

结果10、免疫区室在RV衰竭中重塑，伴随驻留巨噬细胞身份丢失和累积炎症转变

髓系亚型：

• 髓系亚聚类产生6种snRNA-seq群体：CCR2-驻留巨噬细胞、炎症巨噬细胞（iMac）、单核细胞/单核细胞衍生、TREM2、树突状和增殖；肥大细胞仅由Xenium识别。
• CCR2-驻留巨噬细胞表达保守TLF框架（TIMD4、LYVE1、FOLR2）。
• iMac细胞保留驻留标志物同时强烈表达即早基因（NR4A1/NR4A2/NR4A3、FOS、EGR1），并更适度地表达NF-κB靶细胞因子（CCL3、CCL4、IL1B），同时缺乏单核细胞谱系标志物，反映活化驻留而非募集单核细胞状态。
• TREM2细胞表达脂质相关特征，参与吞噬心肌细胞喷射的功能失调线粒体。

伪bulk DESeq2：

• 识别CCR2-驻留巨噬细胞为最响应的髓系群体（pRV vs NF snRNA-seq 169 DEGs；Xenium 10）。
• 第一阶段特征为跨平台驻留/清道夫标志物（VSIG4、CD163）丢失。
• pRV→RVF的snRNA-seq分析未出现单个显著DEG，但炎症转变从NF→pRV→RVF表现为累积。
• 从NF→RVF，驻留巨噬细胞诱导NR4A即早家族、活化标志物CD83和协调MHC-II诱导（HLA-DRB1显著），支持抗原呈递能力增加。
• 髓系WGCNA重现此模式：RVF上调M5富集MHC-II主调控因子CIITA，而RVF下调NR3C1靶点富集M1模块捕获相同的协调驻留身份丢失。
• 将RV和LV髓系细胞共嵌入后，相同的驻留/清道夫标志物VSIG4和CD163在两个心室均下降，识别驻留巨噬细胞身份侵蚀为共享的、腔室无关的心力衰竭特征。

GR反式激活靶点下调：

• 髓系区室内，主导转录变化是GR反式激活靶点的协调、泛髓系下调。
• 经典GR反式激活靶点FKBP5、TSC22D3、ZBTB16和KLF9——连同ANGPTL4——作为早期逐步转变一致下调，在衰竭前（pRV）阶段建立并在RVF中持续，这种下降在髓系亚型中一致而非局限于单一群体。
• 并行地，MHC-II/抗原呈递基因，以主调控因子CIITA为首，以相同早期动力学诱导。
• 关键的是，这种重连是程序特异性的而非泛化炎症激活，两种通常伴随心肌应激的先天免疫轴在疾病阶段中明确不变。NLRP3炎症小体显示其传感器、衔接蛋白、半胱天冬酶或效应细胞因子（IL1B、IL18）的最小诱导。同样，I型IFN/抗病毒ISG反应保持平坦，反对髓系反应的IFN驱动成分。
• 因此，衰竭RV髓系区室显示GR靶基因表达的聚焦、协调转变，没有炎症小体或I型IFN激活。
• 与衰竭LV（扩张型心肌病，DCM）髓系细胞比较显示，这种配置在心室间仅部分保守：MHC-II/抗原呈递诱导共享，I型IFN反应在两者中均保持低水平，而GR靶基因表达丢失和炎症小体激活缺失是RV特异性的。LV DCM髓系细胞反而保留GR靶表达并显示炎症小体诱导。

空间Xenium：

• 将髓系分类细化为8个亚群，增加Mac C1q和肥大细胞。
• 驻留细胞广泛分布，iMacs与单核细胞在组织外周共定位——这一空间模式本身无法区分驻留巨噬细胞的表型转变与单核细胞衍生募集。
• iMacs中TLF标志物保留、iMac非扩张（Kruskal-Wallis不显著）和CCR2收缩与表型转变一致，但iMac/单核细胞空间共现和缺乏基于成像的谱系追踪使驻留细胞转变与单核细胞募集的相对贡献未解决。

结果11、EC在RV衰竭中抑制抗氧化程序并活化

EC亚型：

• EC snRNA-seq亚聚类产生5个聚类，包括心内膜群体（LEPR、NPR3）。
• snRNA-seq显示pRV/RVF中EC扩张由毛细血管和动脉ECs驱动，心内膜和淋巴ECs相对收缩。
• Xenium倾向于动脉扩张而毛细血管比例稳定，反映平台特异性恢复偏差。
• 高维WGCNA（hdWGCNA）解析7个EC模块，ecM1/ecM4/ecM7（毛细血管/动脉/静脉EC程序）在RVF中上调。

第一阶段EC程序：

• 第一阶段稳态特征丢失包括血管保护基因抑制（IL1RL1、主导抗氧化GPX3、ACE2和EDN1）。
• ISGs并行上升，snRNA-seq和bulk一致诱导IFI44L、RSAD2、IFI44、OAS1/OAS2/OAS3、MX1和STAT1（未包括在Xenium 477基因面板中）。

第二阶段EC程序：

• 策划13个第二阶段EC候选基因，跨越五个功能程序：血管生成失稳（ANGPT2、MYC、ADAMTS1）、EC应激（STC1、NR4A1、NR4A3）、EC活化（ACKR1、PLA2G2A）、间充质（SNAI1）和EC身份（VWF、PECAM1、MECOM、CA4），并在EC泛伪bulk中测试跨平台一致性（RVF vs pRV）。
• 功能第二阶段程序清晰验证：血管生成失稳（3/3 Xenium显著+snRNA一致）、孤立的SNAI1事件、ACKR1在第一阶段双相减少并在第二阶段恢复、CA4毛细血管身份侵蚀；EC应激IEGs方向一致但谱系水平FDR modest。
• 三个EC身份/活化候选（VWF、MECOM、PLA2G2A）显示Xenium信号而无snRNA-seq方向一致性。

亚谱系水平：

• 心脏保护性NRG1在第一阶段心内膜ECs中强烈诱导。
• 动脉特化因子MECOM在动脉ECs snRNA-seq中第一阶段视觉趋势上升（值得注意的是，Xenium中第二阶段）；由于MECOM调节人类心脏内皮动静脉特化，成人MECOM诱导可能解释毛细血管/动脉偏向扩张。

结果12 、小鼠PAB模型重现人类RVF的部分而非全部方面

PAB模型：

• PAB隔离RV特异性持续压力过载后果，是肺动脉高压和其他右侧后负荷疾病共享的血流动力学 insult，没有肺血管和全身混杂因素或LV衰竭。
• 分析sham（n=3）和PAB轻或重度RVF（n=3，n=4，按RV扩张分层）的snRNA-seq。
• 大多数细胞群体恢复，除脂肪细胞外，EC扩张和心肌细胞收缩跨疾病状态平行于人类数据集。
• EC扩张在小鼠中 largely 为动脉性，而人类为毛细血管/动脉性，人类EC hdWGCNA模块一致嵌入。
• 髓系细胞（<2%总细胞）分为MHC-II高和驻留巨噬细胞。

与人类RVF的分歧：

• PAB诱导的RV髓系细胞变化与人类RVF广泛不一致。
• 跨单核髓系细胞，PAB未重现人类抗原呈递反应：M8抗原呈递模块未诱导，合并MHC-II模块评分跨严重程度不变。此外，NR3C1（GR）靶基因未显示抑制。
• 由于抗原呈递巨噬细胞是RV髓系细胞的次要部分，用两种正交 assay 直接测试驻留细胞中的MHC-II，两者均显示PAB RV驻留巨噬细胞中活性抑制。
• 流式细胞术显示CCR2-驻留巨噬细胞表面MHC-II（I-A/I-E几何平均荧光强度）以严重程度依赖方式下降（P=0.013），即使白细胞、髓系、巨噬细胞和驻留巨噬细胞频率跨严重程度保持不变。
• 遗传脉冲追踪命运映射（Cx3cr1-CreER；Rosa26-tdTomato）与流式分选 bulk RNA-seq 的长寿命驻留巨噬细胞确认PAB RV驻留巨噬细胞中MHC-II抑制。
• 因此，人类RVF驻留巨噬细胞中诱导的抗原呈递/MHC-II程序在小鼠PAB RV中反而被抑制，确立RVF髓系特征的种间分歧。

小鼠心肌细胞：

• 小鼠心肌细胞Subcluster仅部分映射到人类。
• NPPA/NPPB在两个物种中均上升，但人类线粒体模块显示不一致的小鼠趋势。人类线粒体模块评分趋势在小鼠每动物水平未重现。
• 然而，在基因水平，小鼠PAB心肌细胞显示线粒体转录本协调抑制（MitoCarta基因集富集分析NES=-1.8，FDR<10^-17），方向与成人人类RVF一致，尽管幅度较小且每动物水平不显著。
• 有趣的是，NF→轻度RVF和轻度→重度RVF相关性差，提示轻度RVF是 distinct 状态而非线性中间体，与压力过载严重程度和慢性差异一致而非离散保护机制。
• PAB在Sirius Red组织学上诱导进行性纤维化，聚焦跨物种比较解析程序特异性一致性：FAO和衰竭/胎儿程序跨物种一致，而糖皮质激素轴分歧。

超声与呼吸测定：

• 2周和2个月超声确认进行性压力过载（TAPSE、FAC和收缩下降）。
• 与线粒体基因转录水平降低一致，呼吸测定显示两个时间点呼吸容量降低：2周时，缺陷集中在严重受影响小鼠（重度RVF，耦合复合物I+复合物II+FAO呼吸vs sham约减少35%）；2个月时，渗透到轻度RVF并在重度RVF加剧（约减少50-60%）。
• 因此，线粒体呼吸功能障碍在成人人类和PAB心脏之间保守。

总结：

• 比较人类成人RVF与小鼠PAB诱导RVF，发现：
  • 心脏细胞类型保守，显著缺乏脂肪细胞
  • ECs与RVF一致扩张，小鼠 largely 为动脉性 vs 人类毛细血管性
  • 小鼠髓系细胞MHC-II下调 vs 人类RVF诱导的分歧
  • 两个物种心肌细胞线粒体转录抑制一致（基因集富集显著，小鼠比人类RVF的清晰抑制更 modest）
  • 线粒体呼吸容量显著降低，功能缺陷超过转录变化

结果13、儿童RVF显示与成人RVF相似的转录反应

儿童队列：

• 分析HLHS单心室姑息后的RV（n=5 Fontan无RVF；n=4 Fontan伴RVF；n=1 Glenn伴RVF；无RVF姑息称为ped-HLHS，伴RVF称为ped-RVF）加上儿童对照（n=4；ped-NF）。
• snRNA-seq恢复与成人相似的细胞群体，ped-HLHS/RVF中EC扩张和心肌细胞收缩一致。
• 跨年龄WGCNA模块和全局RVF转录变化相关性良好。

线粒体分歧：

• 在线粒体水平，儿童RV与成人和PAB队列分歧：心肌细胞线粒体模块未清晰诱导，线粒体转录本仅显示适度、非显著下调，方向与成人RVF一致但远更轻微。
• 一致地，儿童内呼吸测定（ped-NF vs ped-RVF）显示ETC复合物活性无显著缺陷（复合物I -9.7%，复合物I+II -2.3%，复合物II +4.1%，复合物IV +42.4%；所有Mann-Whitney不显著），不同于成人RVF和PAB的显著复合物水平缺陷。
• 值得注意的是，保留最大ETC容量不排除底物水平生物能量损伤、降低CPT活性和改变TCA循环通量。
• 数据表明成人RVF特征的严重、协调ETC转录和功能崩溃在儿童HLHS姑息RVs中减弱，而非暗示儿童线粒体代谢全局正常。
• 鉴于小、姑息异质性队列，这些比较统计功效不足，应解读为与成人RVF的相对而非绝对分歧。

髓系与EC：

• 髓系谱系 largely 一致：M1/M3/M4在ped-NF中富集；M8在ped-RVF中富集；MHC-II诱导与成人平行；IRF8靶点在CCR2-驻留巨噬细胞、HLA和CDC cluster中额外抑制（FDR功效不足），伴IRF8维持的经典基因一致丢失。
• 四个成人衍生髓系程序中，MHC-II诱导和缺乏炎症小体或I型IFN信号增加被重现，但未检测到GR反式激活下调。
• 每个程序的主导跨组差异是ped-NF⇒ped-HLHS跳跃而非ped-HLHS⇒ped-RVF，表明压力负荷、全身单RV生理本身（而非衰竭发作）驱动大多数髓系程序转变。
• EC谱系显著分歧：ped-RVF EC扩张以静脉为主；MECOM降低（vs 成人诱导）；动脉化、Notch、SMAD1和NR2F2均不同。

发育锚定：

• 直接比较健康成人vs健康儿童NF RVs：细胞类型共嵌入且分配保守，但显示年龄依赖丰度变化和bulk WGCNA模块表达的谱系特异性差异。
• 心肌细胞伪bulk DESeq2和PCA确认年龄间实质转录分歧。
• 儿童vs成人细胞心肌细胞DEGs的GO富集识别儿童心肌细胞翻译机器vs成人心肌细胞钾通道和钙粘蛋白介导的连接程序。
• 这一发育基线框定跨年龄疾病比较：部分表观儿童vs成人RVF差异可能反映发育设定点分歧而非疾病特异性适应。

总结：

• 比较儿童与成人RVF，发现：
  • 基因表达模块在成人和儿童RVs之间 largely 一致。总体上，RVF期间转录变化存在实质性但不完全的一致性。
  • 两种RVF情况均见内皮扩张，尽管儿童心脏中由静脉ECs驱动 vs 成人心脏毛细血管ECs。
  • 儿童RVF中线粒体基因表达大多不变，不同于成人RVF。一致地，线粒体呼吸也似乎不变。
  • 两种情况下髓系MHC-II表达均诱导。

结果14、RVF和LVF共享核心转录程序、

跨腔室比较：

• 利用人类LV snRNA-seq数据集跨完整RV WGCNA模块集，显示RV模块在LV中广泛保守，NF vs DCM趋势一致。
• RVF和LVF共有的发现包括：
  • 收缩/细胞骨架/粘着斑模块M2诱导
  • 核编码ETC线粒体模块M10、M25、M26和M28抑制
  • NF vs 衰竭伪bulk心肌细胞FCs相关
• 一个腔室特异性分歧从髓系比较中出现：RV iMac群体独特保留TLF驻留标志物。这与（虽不证明）RV iMac混合驻留样状态一致。

结论：

• 核心心力衰竭程序（线粒体抑制、炎症激活和肌成纤维细胞激活）在RVF和LVF之间共享。

Discussion

主要贡献

• 整合bulk、单核和空间转录组学与正交线粒体呼吸、流式细胞术和组织学，构建人类RVF多谱系图谱，从中出现两阶段模型。
• 第一阶段（NF⇒pRV）在bulk和snRNA-seq伪bulk中承载主导转录负担，特征为组织范围保护性程序侵蚀、驻留巨噬细胞身份丢失、成纤维细胞活化、内皮扩张和抗氧化抑制及泛组织FKBP5丢失。
• 代偿到失代偿（pRV⇒RVF）转变最好框定为第一阶段的转录设定点转变（约95%平台解析DEGs），随后是定性不同的、谱系特异性第二阶段程序，包括心肌细胞氧化应激、EC ANGPT2/ADAMTS1诱导与血管重塑一致和成纤维细胞基质细胞活化。

儿童RV的线粒体抵抗

• 一个核心且未预期的发现是儿童单心室RV抵抗成人和小鼠压力过载特征的线粒体衰竭。
• 在成人RVF中，核编码线粒体转录本协调下降，伴随ERRα/PGC-1α生物发生程序抑制，平行损害复合物I+II呼吸功能。
• 小鼠PAB RV显示相同一致下降：心肌细胞线粒体转录本协调下调，伴随呼吸容量降低，尽管每动物转录效应相对于功能缺陷 modest。
• 相反，儿童HLHS姑息衰竭RVs在代谢上被 spared。线粒体转录本既未诱导也未显著抑制，呼吸容量保留。
• 跨队列呼吸模式，成人和小鼠缺陷但儿童单心室RVF无缺陷，连同转录数据，提示成人和小鼠压力过载RVs经历耦合线粒体转录和功能下降。相反，发育中的单心室心脏维持呼吸功能。

iMac群体

• RV髓系区室的一个显著特征是巨噬细胞群体以即早基因程序（包括NR4A1、NR4A3、DUSP2、FOS和JUN）为标志，称为iMac。
• 由于这些转录因子的诱导是单细胞RNA-seq中酶组织解离的公认后果，此类特征常被视为技术伪影。
• 但几条证据反对此解释：
  • 该程序在snRNA-seq中定义，省略了导致伪影的 warm 酶解离步骤，并由原位空间转录组学（Xenium）独立恢复，其中转录本在固定组织上检测而无需任何解离。
  • 特征局限于单一巨噬细胞亚群，并显示可重现的空间组织，与单核细胞在 discrete 组织灶内共定位——这种分布与均匀的、处理诱导的应激反应不相容，后者预期跨所有细胞类型无论身份出现。
  • iMacs还保留左心室图谱炎症巨噬细胞中未观察到的驻留巨噬细胞标志物，提示RV harbors 一种活化的、驻留样巨噬细胞状态，定位于单核细胞积聚部位。
• 无论起源如何，其存在指向RVF中髓系反应的腔室特异性组织。

GR信号破坏

• 发现GR信号破坏的证据：FKBP5组织范围丢失和NR3C1反式激活靶点的协调、泛髓系抑制，尽管证据限于转录状态。
• 由于GR可结合正性和负性糖皮质激素反应元件（GREs）并相应驱动诱导或抑制，GRE相关转录本下调本身不意味着GR活性降低。
• 因此，GR信号方向不能仅从靶基因表达推断，改变糖皮质激素信号的功能验证需要专门研究。
• 然而，PAB模型仅部分重现此人类特征（NR3C1靶点不变），限制其研究RV糖皮质激素生物学的效用。

内皮扩张

• 在成人、儿童和成人中pRV/RVF所见的内皮扩张在心力衰竭转录组研究中有些不寻常，但已在缺血性左心室心肌病背景下报道。
• 假设这反映冠状动脉微血管对RV特异性血流动力学的适应（薄壁腔室在收缩期和舒张期均灌注），驱动代偿性毛细血管/动脉扩张以在压力负荷下维持氧输送，成人MECOM动脉诱导和儿童静脉主导扩张反映不同发育背景。
• 第二阶段血管生成素轴失稳（ANGPT2、MYC、ADAMTS1）提示这种初始代偿性血管反应在失代偿时向失稳转变。
• 功能验证将需要灌注成像、血管铸型或介入EC研究。

小鼠PAB模型的效用与局限

• 更广泛地，小鼠PAB重现人类RVF的血流动力学负担，并在代谢和结构程序方面与人类RVF汇聚：核编码线粒体基因抑制、呼吸容量降低、心肌细胞胎儿基因再激活、内皮扩张和进行性纤维化。
• 然而，在免疫和激素程序方面分歧，最显著的是髓系抗原呈递（MHC-II/CIITA）和糖皮质激素信号，以及更精细特征如小鼠所见动脉偏向内皮扩张。
• 该模型因此非常适合研究RV代谢和纤维化重塑，但在免疫或糖皮质激素通路方面应谨慎应用。

与其他研究比较

• 在NF人类心脏中，右心室和左心室几乎转录相同。四腔室图谱报告心室间仅约24个基因差异表达，而每个房室对比超过1,000个，暗示RVF中解析的RV特异性程序是疾病 emergent 而非基线腔室身份的反映。
• 与匹配衰竭LV/DCM图谱相比，衰竭RV和LV共享实质核心转录程序（线粒体抑制、细胞骨架重塑和免疫激活），并在局灶程序如糖皮质激素轴丢失和炎症小体诱导减少方面有RV特异性分歧。
• 大鼠PAB（RV）vs 主动脉环缩（LV）模型同样显示基线心室转录组广泛重叠（约91%共享），但RV疾病反应 distinct 更强，以及跨大鼠PAB和人类慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）的保守分泌/基质右心衰竭特征约50个基因。
• 值得注意的是，孤立后负荷建模认为RVF和LVF largely 不同：仅2.2%人类LVF基因与大鼠PAB调控集重叠。 predominantly LVF继发队列是有信息的例外：其RVF共享衰竭LV的广泛心肌病核心，归因于LVF相关RVF的共同心肌和全身基质，而非环缩模型中驱动RV vs LV分歧的孤立后负荷。

转化意义

• 这些比较具有转化意义。LVF相关RVF与LVF之间共享的核心分子病理提示，LV导向指南指导药物治疗（GDMT）在孤立RVF中的临床失败反映非心脏靶点、生物力学背景、腔室几何或上游血流动力学触发因素的参与，而非根本不同的分子通路。
• 结合平行的血浆LTBP-2生物标志物研究，此处识别的纤维化相关RV转录本可能最终作为RV重塑的生物标志物。
• 总体上，识别的多谱系微环境重塑提名抗纤维化策略（特别是TGFBR3）、免疫调节方法和直接线粒体功能支持作为可能的RV特异性治疗途径。

局限性

• snRNA-seq队列（n=11）尽管是人类RV中最大的之一，仍 modest。通过更大的bulk队列（n=142）和关键主张的跨平台一致性来解决。
• Xenium每组n=3可用，限制CellChat推断，且限于477基因面板，因此面板外主张（特别是POSTN、FKBP5、TGFBR3和MLIP）仅依赖bulk和snRNA-seq。
• 此外，第二阶段信号在跨平台定量上有限。内皮EndoMT和心肌细胞再激活程序将需要靶向功能验证。

方法总结

SnRNA-seq：

• 环境RNA和噪声去除：使用CellBender remove-background，超参数调优确保平滑收敛。CellBender去噪计数矩阵进一步用DecontX处理以估计和减去残留每细胞环境污染。
• 过滤和质量控制：核>5%线粒体转录本、<200转录本或>100,000转录本丢弃。计算每个核的熵和exonic百分比。异常值标记并去除。
• 样本整合：11个单核数据集使用R Harmony包整合。使用RunHarmony生成批次校正PCA组件（50维），用于所有下游邻居图构建、聚类和UMAP嵌入。
• 参考映射：使用Seurat version 4参考映射管道。参考和查询数据集通过SCTransform预处理。参考数据集使用CCA整合而非Harmony。识别锚点并用于将查询数据映射到整合参考。
• 差异基因表达：使用FindMarkers函数，默认Wilcoxon秩和检验。仅保留log2FC>0.1的基因，调整P<0.05视为显著。
• 伪bulk差异基因表达：使用AggregateExpression函数对每种主要细胞类型求和计数。通过DESeq2进行差异基因表达分析。Benjamini-Hochberg FDR在每个DESeq2运行内校正。
• 富集分析：使用Enrichr web界面和RenrichR包。输入为感兴趣cluster中上调或下调基因。
• PAH比较：重新分析PAH RV bulk RNA-seq数据集。原始计数矩阵从GEO（GSE240941）获得，使用与成人RV bulk数据相同的DESeq2管道处理。
• 线粒体转录因子分析：跨三个分析轴评估线粒体生物发生转录调节因子（每患者伪bulk DESeq2表达、CollecTRI/decoupleR转录因子活性推断和MitoCarta3.0模块评分）。

空间转录组学：10x Xenium：（477 panel）

• 空间分辨细胞的亚聚类在每个12主要细胞类型内使用Seurat（version 5）进行。
• 空间生态位识别使用Seurat的BuildNicheAssay函数，k=100最近空间邻居。所有心肌细胞亚型在生态位计算前合并为单一标签。CLR变换应用于生态位比例向量，然后z-评分。Mini-batch k-means聚类（k=15）。共享相似组成的cluster合并为14个最终生态位。生态位比例跨疾病组（NF、pRV、RVF；n=3每组）使用Kruskal-Wallis检验和Benjamini-Hochberg校正比较。

空间转录组学：CellChat细胞-细胞通讯分析：

• 为在保留空间背景的同时推断RV心肌内细胞间信号，结合单核表达与Xenium空间坐标。由于Xenium面板仅测量477基因，单核表达首先每患者插补到Xenium细胞上，使用每患者自己的匹配snRNA-seq数据集作为参考。
• 细胞类型注释合并为13个广泛组。CellChat每患者单独运行。使用插补表达矩阵、谱系注释和Xenium细胞质心构建空间CellChat对象，空间比例因子源自Xenium坐标系统。配体-受体相互作用来自CellChatDB.human。使用截断均值方法（trim=0.25）在空间约束下计算通讯概率。少于5个细胞支持的相互作用移除。
• 为聚合网络可视化，每患者CellChat对象限制在心肌生态位，在每种条件下跨患者平均（NF n=3；pRV n=3；RVF n=3）以防止任何单一个体主导。边权重按发送者和接收者细胞类型比例乘积归一化以控制条件间组成差异。通路排名时，计算每种条件下每通路所有配体-受体对的通讯概率总和并归一化至每种条件下总和为1。

生活很好，有你更好。