单细胞技术梳理（四）

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Smart-seq2

前面我们介绍了下Smart-seq技术。Smart-seq2是经Smart-seq改进的一种测序方法，也目前最常用的单细胞转录组技术之一。Smart-seq于2012年开发，一年后针对Smart-seq的改进版Smart-seq2《Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2》发表在《Nature Methods》上 。与Smart-seq相比新的方法使用锁核酸（LNA）、更高浓度的MgCl2 以及三甲基甘氨酸(N,N,N-trimethylglycine)，并且不再需要纯化步骤，比Smart-seq产量更高。可以更好的用于检测可变剪接，SNP突变，融合基因等遗传调控分析。

流程

Smart-seq2库准备流程图

技术大致流程：

• 使用相对温和(低渗)的裂解缓冲液（在裂解液中加入MMLV逆转录酶、游离的dNTPs、oligo(dT)VN Primer、甜菜碱、MgCl2等），在不干扰或抑制RT反应的情况下裂解细胞，制成单细胞悬液
• 加入反转录引物和末端转移酶。Oligo(dT) primer 经过退火结合到mRNA的poly(A)，逆转录酶MMLV开始进行逆转录。（模板转换反应依赖于当RT到达RNA的5'端时末端转移酶活性会额外添加到cDNA3'端2-5个非模板核苷酸）
• 加入含LAN的TSO（模板转换引物），通过逆转录酶进行模板切换。
• 添加ISPCR单引物用于cDNA扩增，得到全长cDNA序列
• 利用PCR扩增全长cDNA以获得后续步骤所需的足够的材料
• 片段化，利用Tn5转座酶打断并标签化
• 加接头，构建标准的Illumina测序文库，然后上机测序

优势与局限

优势：

• 使用相对温和的裂解缓冲液，来尽量达到对后续反转步骤最小的影响
• 使用甜菜碱（一些RNA会形成发卡或者环等二级结构使反转酶受到空间位阻可以通过甜菜碱或者海藻糖克服）提高酶的热稳定性，反转效率等。
• 使用LAN锁核酸（rGrG+G，+G指的是锁核酸修饰），增加核酸双链热稳定性并提高杂交的特异性，促进模板转换。
• 加入Mg2+以结合甜菜碱羧酸盐阴离子形成离子对，以提高cDNA产量。
• 成本相对较低，Smart-seq2利用现成的试剂比广泛商用的SMARTer kit可以以更低的成本生产更高质量的文库
• 应用范围更广，相对于截短的cDNAs，M-MLV逆转录酶更倾向于选择全长cDNAs作为其末端转移酶活性的底物。因此每个转录本的所有外显子都能被检测到，这使它可以用于检测可变剪接，还可以在转录本层面进行全面的SNP和突变分析，扩大了其应用范围
• 更灵活，能够进行多样品混合测序
• 不再需要纯化步骤，比Smart-seq产量更高
• 方便改良，由于Smart-seq2的方案和原理都是公开的，研究人员可以更方便的进行改良

限制：

• 由于对聚腺苷酸化的RNA具有选择性，所以不能分析非poly(A)尾的RNA
• 测序reads不带有mRNA链特异性