【药物设计】Science: AlphaFold2 结构模型指导药物发现

5月16日，美国加利福尼亚大学旧金山分校 Brian K Shoichet 教授、北卡罗来纳大学教堂山分校 Bryan L Roth教授等研究团队共体在《科学》杂志发表题为“AlphaFold2 structures guide prospective ligand discovery”的研究论文。

研究人员针对 σ2 受体和5-HT2A受体的未经优化的AF2模型前瞻性地对接了大量化合物库，测试了数百种新分子，并将结果与针对实验结构对接的结果进行比较。无论是在实验结构还是AF2模型上，命中率都很高且相似，亲和力也是如此。

通过冷冻电镜确定了AF2对接中一个较为高效的5-HT2A配体结构，揭示了残基适应性调整，这些调整与AF2预测相似。AF2模型可能捕获到与实验结构不同的构象，但这些构象仍然是低能量状态且对于配体发现至关重要，从而拓展了基于结构的配体发现领域。

研究背景

Alphafold2 在蛋白质结构预测方面的突破，展示了前所未有的能力，能够以原子级精度预测蛋白质结构，并且能够大规模运行。截至目前，AlphaFold数据库包含了人类蛋白质组及另外47种生物体的蛋白质结构信息，覆盖了超过2亿个蛋白质，几乎囊括所有潜在的治疗性蛋白质靶点。这些结构在结构生物学应用、蛋白质设计、蛋白质-蛋白质相互作用、目标预测、蛋白质功能预测以及生物作用机制研究等方面展现出极高的价值。

然而，AF2结构对于基于结构的配体发现的影响尚不明确。在配体结合位点，对低能量构象的高度忠实度被认为至关重要，即便是相对其他应用而言微不足道的小错误也可能干扰配体识别和构象预测。尽管回顾性研究表明，与对照分子相比，使用未经优化的AF2模型进行对接实验，在识别已知配体和预测其构象方面存在困难，而在与实验结构的直接对比中表现更佳。这类研究的一个缺点在于它们受到历史偏见的影响：即已知配体在确定复合物结构时可能会影响实验结构采取的构象，而实验结构又可能影响新配体探索的过程。

研究方案

首先，研究人员对比了 AF2 模型对σ2受体 （EXPERA）和5-HT2A受体（GPCRs）的结构预测。因为AF2模型在这两种受体的晶体结构公布之前就已经进行了预测，这有助于减少可能的偏差。

于σ2受体，AF2模型准确地预测了所有正性位点残基的侧链构象，与晶体结构的均方根偏差（RMSD）仅为1.1埃。只有少数几个残基的个别RMSD值大于1.5埃。对于5-HT2A受体，虽然大多数结合位点残基预测得很好（与冷冻电镜结构的RMSD小于2埃），但有两个残基的RMSD在2.5到3.1埃之间，它们采取了不同的旋转异构体。

随后，研究者使用DOCK3.8软件对数百万种可能的配体姿态进行采样，并对每种分子姿态进行物理适配性评分，通常是针对一个预定义且保持固定的结合位点。在DOCK3.8中，配体与蛋白质的适配性是通过计算两种相互作用来评估的：使用泊松-玻尔兹曼方程的探针电荷模型来计算静电相互作用，以及使用AMBER势函数来计算范德华相互作用，并对这些项进行配体脱溶和构象应变的校正。

对于σ2受体的晶体结构，研究者之前筛选了来自ZINC20库的4.9亿个可对接的分子。在排名最高的30万个分子（占排名库的0.06%）中，有138个高分分子通过放射配体竞争测试，其中70个在1μM的浓度下取代了超过50%的已知配体[3H]-DTG，命中率为51%。最好的21个活性分子的Ki值在1.8纳摩尔到低微摩尔范围内，其中19个Ki < 50 nM，6个Ki < 5 nM。

同时，研究者将相同的4.9亿个分子库对接到σ2受体的AF2模型上，选择前30,000个对接中的119个新分子进行合成和测试。其中，64个分子在1μM浓度下取代了超过50%的[3H]-DTG特异性σ2结合，命中率为54%。尽管略高于晶体结构对接测试中观察到的51%，但两个命中率在z-test基础上没有显著差异。AF2测试中前18个命中的Ki值在1.6 nM到84 nM之间，有13个Ki值小于50 nM，2个小于5 nM。

当研究者将这4.9亿个分子库重新对接到σ2的AF2模型时，这些之前排名很高的138个分子的排名下降得如此之多，以至于它们不再位于前30,000名之内。这可能反映了AF2正性位点相对于晶体结构的轻微缩小，计算体积从268 ų分别下降到213 ų。

相应地，当使用晶体结构（logAUC: 39）与AF2模型（logAUC: 16）对ChEMBL数据库中的已知σ2配体与属性匹配的诱饵库进行对接时，晶体结构返回了更高的富集度。针对5-HT2A受体的冷冻电镜和AF2结构的相关回顾性研究也有类似的结果：实验结构在对已知配体进行回顾性富集方面，比AF2结构更胜一筹。

与σ2受体的情况不同，5-HT2A受体的AF2模型与冷冻电镜结构相比，在几个正性位点残基上表现出明显的旋转异构体变化。尽管大多数正性位点残基的RMSD小于1.5埃，关键残基TM5上的Phe-2345.38和ECL2环上的Leu-22945.52在两个结构中分别相差2.5和3.1埃，采用了不同的旋转异构体。由于AF2模型借鉴了相关5-HT受体家族的整体序列相似性，并且因为冷冻电镜结构代表了与Gαq复合的受体的活跃状态，而AF2模型更接近非活跃状态，研究人员预期实验结构更有可能选择具有5-HT2A选择性和Gαq偏向性的激动剂。

随后，研究人员将超过16亿个分子分别对接到冷冻电镜和AF2受体结构上，考虑了每种结构对接后的前300万个（前0.2%）分子，并对两种结构应用了一致的过滤、聚类和命中选择标准，以减少这些分子到一组优先合成和测试的分子。最终，针对冷冻电镜结构对接的223个高排名分子和针对AF2结构对接的161个高排名分子被合成。

初步的放射配体结合筛选试验中，针对冷冻电镜结构对接的223个分子中有51个在对接配体的10 μM浓度下取代了超过50%的[3H]-LSD，命中率为23%。与此同时，针对AF2模型对接的161个分子中有42个达到了这个阈值，命中率为26%。出乎意料的是，来自AF2对接的三个亲和力最高的化合物（15到24 nM）全部来自AF2对接，而来自冷冻电镜对接的三个最佳化合物的亲和力大约弱五倍（在71到114 nM之间）。尽管AF2对接的命中率更高，但根据z检验，它们与实验对接的命中率没有显著差异。与此同时，在两项测试中的93个活性分子中，没有两个共享相同的骨架，Tc平均成对相似性为0.27，接近随机。

由于 5-HT 受体在人体具有多个不同的亚型，为了评估分子的亚型选择性特性，研究人员对来自AF2和实验数据对接的338个优先分子，评估它们对于的功能性活性（包括激动作用或拮抗作用），包括在5-HT2A、5-HT2B和5-HT2C受体中的亚型选择性，以及在Gαq激活或β-arrestin2招募之间的配体偏向性。

在用每个化合物3 μM处理后，来自冷冻电镜对接组的10个化合物和来自AF2对接组的6个化合物显现为5-HT2A激动剂，定义为≥10%的5-HT反应；此外，另有10个化合物（5个冷冻电镜和5个AF2）和6个化合物（3个冷冻电镜和3个AF2）分别是5-HT2B和5-HT2C激动剂。在3 μM下筛选拮抗模式下，5个化合物（1个冷冻电镜和4个AF2）拮抗了5-HT2A受体活性，定义为≥20%的氯氮平活性。此外，我们发现了17个化合物（10个冷冻电镜和7个AF2）和1个化合物（冷冻电镜）分别在5-HT2B和5-HT2C受体上具有拮抗活性。

进一步的活性研究显示，来自冷冻电镜对接组的顶级激动剂的效力（pEC50值）范围从246nM到3uM，而来自AF2对接组的则从42nM到1.6uM。在顶级五个AF2激动剂中，有三个（Q2118、Z7757和Z2504）对5-HT2A受体相对于5-HT2B和5-HT2C受体显示出亚型选择性。与此同时，没有一个顶级冷冻电镜激动剂显示出5-HT2A受体选择性。在完整的浓度反应中，是AF2衍生的激动剂作为最有效和选择性的分子脱颖而出。

研究小结

研究结果与预期相反，表明使用AF2模型进行的大型库对接与使用实验结构进行的对接同样有效。对于σ2和5-HT2A受体，数百个分子在两种结构上进行了实验测试，命中率高，并且在AF2模型和实验结构之间没有显著差异。这些分子的亲和力比较也得出了类似的结论。实际上，对于5-HT2A受体，AF2结构产生的化合物甚至可能更具效力和选择性，其中对接命中的中nM EC50值在针对该目标的广泛基于结构的对接中排名为最强和最具选择性的分子之一。冷冻电镜结构证实了新激动剂Z7757的模型预测：对接预测与新的冷冻电镜结构的位置很好地重叠，甚至原始AF2模型与lisuride/5-HT2A冷冻电镜结构之间的一些关键结构差异在新的Z7757/5-HT2A复合物的冷冻电镜结构中得到了再现。这些观察结果与AF2模型捕获了5-HT2A受体的低能量、可访问状态的观点一致。

最后，作者提出AF2模型采样的替代构象捕获了低能量构象，这对于识别与实验结构识别的配体不同的配体很有用。在针对5-HT2A受体的对接测试中，来自AF2对接的命中的功能特性并不比来自实验结构对接的差。值得注意的是，三个5-HT2A受体命中来自AF2模型的对接是亚型选择性的，这在针对冷冻电镜结构的对接中没有看到。AF2模型可以扩大针对结构基础发现的蛋白质范围和发现的有效化学类型的广度。