Cell Stem Cell | 类原肠胚发育的动态蛋白表达图谱及细胞类型异质性解析

景杰生物 | 报道

随着生物医学研究的深入，胚胎发育的分子机制逐渐成为科研工作者关注的焦点，同时也一直是基因组学、蛋白组、表观遗传组学等研究领域的热点。胚胎发育是一个复杂而精细调控的过程，涉及多个阶段和多种细胞类型的协调发展，在这些阶段中，原肠胚形成（gastrulation）是至关重要的，类原肠胚（gastruloid）作为体外胚胎模型，可模拟早期胚胎发育的关键阶段。虽然单细胞RNA测序以及表观基因组学技术已被广泛用于描述类原肠胚中不同细胞类型的特征，但最近整合转录组和蛋白组数据发现蛋白质和mRNA表达水平并不相关，且关于早期哺乳动物胚胎发育的蛋白质组学研究却相对缺乏，这提示基于蛋白质组学研究的重要性和必要性。

此外，单细胞蛋白质组学可以在单个细胞层面，揭示细胞群体中的个体细胞之间的差异和异质性，进而深入了解细胞在不同状态下的功能和表达水平的变化，从而揭示细胞群体中隐藏的多样性和特异性。然而，截至目前也尚未对植入后胚胎或基于干细胞的胚胎发育模型进行基于质谱的单细胞蛋白质组学分析。

近日，荷兰奈梅亨大学Oncode研究所Michiel Vermeulen研究团队在国际知名学术期刊Cell Stem Cell（IF=23.9）上在线发表了题为“Deciphering lineage specification during early embryogenesis in mouse gastruloids using multilayered proteomics”的最新成果。该研究对不同发育进程的小鼠类原肠胚及小鼠胚胎进行了蛋白质组学、单细胞蛋白质组学、磷酸化修饰组学、增强子蛋白质组学分析，描绘了类原肠胚分化过程中蛋白及磷酸化的动态表达图谱。重要的是，研究通过单细胞蛋白质组学分析揭示了类原肠胚中细胞类型的异质性，为理解细胞分化和命运决定提供了新的视角。

1.小鼠胚胎干细胞（mESCs）向类原肠胚分化的不同时间点蛋白质组学分析

为了评估类原肠胚形成过程中的蛋白质组动力学，研究对未分化的mESCs到120 h的类原肠胚的五个不同时间点（0h、48h、72h、96h和120h）样本进行蛋白质组学分析(图1A)，共鉴定到5079种蛋白质，并揭示了分化过程中不同的蛋白质表达模式。此外，研究还揭示了mRNA和蛋白质表达动态关系，发现特定基因在不同胚胎阶段有明显表达，部分差异表达蛋白表现与转录水平相似的动态，该结果为早期胚胎发育过程提供重要信息。

图1 mESC向120 h类原肠胚分化的时间分辨蛋白质组学分析

2. 类原肠胚和着床后小鼠胚胎的蛋白质组特征比较分析

接着，研究对四个不同发育时间点(E7.5, E8.0, E8.5, E9.5)的胚胎样本进行了蛋白组学研究，结果共鉴定到5998种蛋白质。通过比较小鼠胚胎和类原肠胚的蛋白质组学特征发现，有4,736种蛋白质在二者中均被检测到，表明二者之间有显著重叠。此外，研究发现不同发育阶段的蛋白质产生了明显的分离，与多能性、神经元发育和体细胞分化相关的特定蛋白质表达呈相似的变化趋势。总之，蛋白质组学数据说明类原肠胚能够很好地模拟发育过程中天然胚胎的蛋白质组特征变化。

图2 小鼠胚胎与小鼠类原肠胚的蛋白质组学分析比较

3. mESC向类原肠胚分化的时间分辨磷酸化修饰组学分析

为进一步分析类原肠胚形成过程中的动态信号通路，研究对未分化mESCs、72 h类原肠胚和120 h类原肠胚进行了磷酸化修饰组学分析（图3），结果发现近6000个显著调节的磷酸化修饰位点，其中大部分在未分化mESCs中。此外，激酶富集分析发现在未分化的mESCs中，特定激酶的活性增加，特别是在120小时的类原肠胚中，C2H2型锌指转录因子家族成员大量被磷酸化。总之，这些发现揭示了在mESCs分化为类原肠胚过程中动态变化的信号通路。

图3 mESC向120 h类原肠胚分化的时间分辨磷酸化修饰组学分析

4. 单细胞蛋白组学捕获胚层特异性细胞异质性

单细胞蛋白质组学是解锁细胞异质性的利器，为了鉴定胚层特异性蛋白质组，研究人员通过荧光标记和流式细胞术分选，结合单细胞蛋白质组学技术系统分析了类胚胎中不同胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的特异性蛋白质表达谱，即对SOX17-RFP+（内胚层）、BRA-GFP+（中胚层）和MT1-BFP+（外胚层）细胞以及未分化的mESCs进行基于CellenOne平台的单细胞蛋白质组学分析，平均每个细胞检测到1541种蛋白质。主成分分析显示，不同胚层的细胞群体呈各自独特的蛋白质表达特征。

进一步的，研究对BRA-GFP标记的中胚层细胞展开了深入研究，通过单独分选这些标记细胞并进行单细胞蛋白质组检测，成功鉴定出三个细胞亚群。这三个亚群展示出不同的神经中胚层前体、前体节中胚层和体节评分，表明它们在中胚层中扮演着不同的功能角色。此外，研究者还观察到在BRA-GFP细胞的一个亚群中角蛋白高表达，这可能与中胚层的发育和形态发生相关。这些发现为进一步理解中胚层细胞的功能和特性提供了重要线索，有助于深入研究中胚层相关的生物学过程和疾病机制。上述实验结果提示单细胞蛋白质组学对于研究细胞异质性具有重要意义，同时为理解早期胚胎发育中的细胞命运决定和细胞类型的动态变化提供了宝贵的数据。

图4 单细胞蛋白组学揭示胚层特异性细胞异质性

5. 增强子蛋白质组学揭示可识别mESC和类原肠胚的转录因子

进一步地，为了识别与增强子结合的蛋白质并揭示在类原肠胚中富集的转录因子，研究利用增强子蛋白质组学分析，揭示了许多类原肠胚特异性转录因子和染色质重塑因子。类原肠胚细胞中ZEB2的缺失导致表面外胚层和神经外胚层的扩张，同时伴有体细胞中胚层的减少，突出了ZEB2在早期胚胎发生中的重要性。

综上所述，该研究基于蛋白质组学和磷酸化修饰组学，以时间分辨方式描述了小鼠类原肠胚蛋白和磷酸化修饰的动态变化图谱，并通过单细胞蛋白组学技术成功揭示了不同胚层细胞和未分化mESCs的特异性蛋白表达谱，揭示了各种细胞类型在蛋白质表达上的差异，探索了与不同细胞群相关的生物学过程和信号通路，尤其是角蛋白在中胚层细胞中的潜在功能。这些发现为理解胚层特异性蛋白质组在胚胎发育过程中的重要作用提供了深入的见解。

图5 该研究概要图

景杰评述

本研究利用的多层蛋白质组学技术，凸显出了以蛋白组学为核心的多组学研究新范式，也进一步证明了蛋白组学作为驱动精准医学的主要推动力。值得注意的是，本文运用单细胞蛋白组学证实了每个胚层都具有独特的蛋白时间表达谱，并强调了单细胞蛋白质组学对于胚层细胞亚群以及特征蛋白标志物发现发挥的重要作用。此外，作为“蛋白质组学明珠”之称的单细胞蛋白质组学，可在单个细胞层面上分析蛋白质的表达，从而提供一个新视角来深入理解细胞的复杂性和异质性。正如本文中提及的：研究者利用单细胞蛋白质组学技术能够在小鼠胚胎体外模型——类原肠胚中揭示胚层特异性的细胞异质性，这对于解析早期胚胎发育过程中的细胞命运决定至关重要。

然而单细胞蛋白质组学在单细胞分选、样本前处理、鉴定深度和检测通量等方面仍面临诸多挑战。为进一步满足对单细胞蛋白组学研究的需求，景杰生物于2021年8月在业内首次推出“真”单细胞蛋白质组学后，历经三载春秋的磨砺沉淀与锐意创新，持续克服单细胞蛋白质技术局限的障碍，现荣耀升级“单细胞蛋白质组学2.0”解决方案，基于行业领先的全流程集成自动化的前处理平台CellenONE、结合景杰独家开发单细胞蛋白质前处理体系、运用行业领先的10X Proteomics技术以及景杰专属单细胞水平的蛋白质组学专属生信分析流程，四大技术体系革新飞跃，深度揭秘生命密码（点击链接详细阅读：景杰生物 | 单细胞蛋白质组学2.0荣耀升级，独家革新技术揭秘生命密码）。如果您想了解景杰生物研究产品和服务的更多信息，可咨询景杰生物销售工程师、或拨打科服热线400-100-1145。

参考文献：

Stelloo S, et al. 2024. Deciphering lineage specification during early embryogenesis in mouse gastruloids using multilayered proteomics. Cell Stem Cell.