三维相干显微镜在生物医学的25年历程 | 谢晓亮《自然-方法》评论

作者：谢晓亮

本篇原载于：《自然-方法》（Nature Methods）

首台三维相干拉曼显微镜问世已逾二十五年。在全球科研工作者的共同努力下，相干拉曼成像已经发展为一个独立的研究方向，并在化学、材料、环境及生物医学等多个领域广泛应用，成果斐然。值此之际，作为该领域发展的亲历者，我愿与大家一同回顾这段非线性光学与显微成像的技术历程，梳理其在生物医学成像革命中的重要突破。

2011年，密歇根大学举办了一场“非线性光学五十周年”的研讨会，留下了一张珍贵的历史合影（图一）。这场盛会旨在纪念Peter Franken团队于1961年首次发现光学二次谐波，由此催生出众多技术应用，包括如今随处可见的绿色激光笔。遗憾的是，彼时Franken已不幸辞世，未能亲睹此盛况。前排就座者中，有1981年诺贝尔奖得主、哈佛大学非线性光学先驱Nicolaas Bloembergen，以及2018年诺贝尔奖得主、密歇根大学飞秒激光脉冲技术的开拓者Gérard Mourou等多位学界泰斗。而后排站着当年在福特汽车公司为研究燃气火焰而发现相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）1现象的Paul Maker。尽管CARS一词并非由他所创，而是由斯坦福大学Bruce Hudson提出2，但Maker的研究为相干拉曼谱学奠定了基石。会上，我有幸分享了非线性光学、特别是相干拉曼成像对生物医学发展的深刻影响。

图一：密歇根大学为庆祝Peter Franken（右图）于1961年发现光学谐波而举办的“非线性光学五十周年纪念研讨会”。坐在前排的是两位诺贝尔奖获得者Gérard Mourou和Nicolaas Bloembergen（左起第二和第三位）。站在后排的是Paul Marker（右二）和笔者（左二），分别是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）光谱学和CARS显微镜的早期开拓者。

时间回到1928年，印度物理学家Chandrasekhara Venkata Raman（C.V.拉曼）用自制光谱仪捕捉到分子非弹性散射的光频移现象3（图二），后来被命名为“拉曼效应”。这一发现为他赢得了1930年诺贝尔物理学奖。但自发拉曼信号极其微弱，需要极高的探测灵敏度才能捕捉到。直至1960年代激光技术成熟后，基于分子本征振动的拉曼光谱才开始在化学分析中大展身手。然而对化学和生物成像而言，传统拉曼技术信号强度仍微弱耗时。

图二：拉曼光谱在扫描生物样品时展示出不同分子化学键的振动频率（左图15）。Raman（中图）与他自制的光谱仪（右图）。照片由笔者提供。

激光技术问世后，CARS1和受激拉曼散射（SRS）4等相干拉曼技术应运而生。当两束不同波长激光的频率差匹配分子振动能级时，相干振动将产生非线性信号（图三）。这些信号为快速拉曼成像提供了理论基础。

图三：相干拉曼过程能级示意图7。

1999年，我在美国太平洋西北国家实验室（PNNL）偶然踏上了CARS成像的探索之旅。最初我在PNNL的任务是搭建起一个超快激光实验室，用来开展红外光子回波实验。为此我团队的激光专家Gary Holtom搭建了一台钛-蓝宝石激光系统。然而没等Gary建完，其他实验室已经捷足先登，率先完成实验；我们的设备却因功率不足而不堪使用。眼看前期心血付诸东流，我很是头疼。没曾想绝处逢春，一次倍频试验中，当我组里的德国博士后Andreas Zumbusch利用这台设备将两束激光（ω1，ω2）同时投向同一张玻片上时，意外观测到了白光，且其色散呈现出两束入射光激光频率的线性组合ω1+ω2（图四）——这吻合当时已为人熟知的CARS现象，即当分子振动频率与ω1和ω2相匹配时会产生共振。于是我们很快决定将2ω1-ω2信号作为成像对比度重点观察，很快发表了全球首张三维非线性拉曼图5。

图四：Andreas Zumbusch在美国太平洋西北实验室（PNNL）观测到的两束入射激光产生的频率线性组合现象。

在把发现整理成论文时，我们注意到Duncan团队早在1982年就已经报道了世界首台CARS显微镜。这项远超时代的工作利用了彼时极难操作的皮秒染料激光器，并将二维探测器放置在两束交叉激发光束的相位匹配方向来实现成像6（图五A）。我们另辟蹊径，用两个共线激光束对样品进行共焦扫描（图五B），不仅放宽了相位匹配条件5,7，还做到了三维成像。

图五: 相干拉曼成像的四种探测光学设计。A）相位匹配方向上的探测6；B）相对于样品的两个共线激发光束的光栅扫描聚焦点5；C）使用大面积光电二极管对高散射样品的背向散射光进行Epi检测8；D）两束松散聚焦光束的光栅扫描，用于大视场观测（来自昌平实验室王平博士的专利申请）。

转赴哈佛后，我的团队相继取得了两大技术突破。先是组内的Chris Freudiger、Min Wei等人开发了SRS显微镜7，它消除了非共振背景，使谱图与自发拉曼光谱高度一致，实现了对CARS的技术优化。而后Brian Saar和组员们实现了视频帧率的高速SRS成像8。为提高灵敏度，我们在SRS成像中引入了高频强度调制的信号转移技术应用于单束激发光7，并对拉曼位移进行高频调制优化。随着激光技术尤其是光纤的发展9，相干拉曼成像的稳定性、易用性不断提升，成本逐步降低。

目前相干拉曼显微镜已广泛应用于脑肿瘤手术，它能快速识别肿瘤边界10（图六），与用于传统H&E切片组织染色技术相比，大大减少了人力与时间成本，并实现了对人体的活体组织成像（图六）。不仅如此，对葡萄糖、胆固醇、DNA、小分子药物的活细胞成像，以及多路复用小型拉曼探针的技术开发也陆续问世，见刊成书11,12。如今单分子相干拉曼检测、超分辨拉曼显微镜13等新兴技术不断涌现，并在企业推动下实现了商业应用。

图六：受激拉曼散射（SRS）成像。SRS显微镜对小鼠大脑进行扫描（上左图），可以通过对比度区分脑肿瘤组织（蓝，富含蛋白质）与正常组织（绿，富含脂质）（上右图），而常规光学显微镜无法区分（上中图）10。一名志愿者在通过多烯烃伸缩振动差异来检测维生素E在其手臂皮肤上的渗透情况（下图）。比例尺为1 µm。

1978年，在拉曼效应发现五十周年之际，Bloembergen曾自信地预言：“自发拉曼谱学前半世纪的繁荣，将开启相干非线性拉曼技术后半世纪的辉煌。”14如今距这场世纪之约不到4年，相干拉曼成像领域果然硕果累累（图七），看来大师的预言即将成真。

图七：相干拉曼成像的科研论文出版趋势与 Nicolaas Bloembergen（1920-2017年，插图）的预测不谋而合。

回顾这段历程，我很荣幸能参与到这项技术的早期开发。我们的工作建立在巨人的基础之上——非线性光谱学和超快激光技术已经问世，与生物医学的交叉应用也适时兴起。即便没有我们，相信也会有其他学者完成这些研究突破。我特别感谢PNNL所提供的优越条件，不仅有充足的资源支持，也营造了包容失败、鼓励探索的科研环境。我也非常珍惜在哈佛大学二十的时光，正是那种积极进取、鼓励创新的氛围激励着我的团队不断挑战极限。令人感叹的是，C.V.拉曼爵士，这位来自东方的科学巨匠，他的发现竟让全世界的科学家们忙碌了近一个世纪。

致谢：

本文作者由衷感谢其团队的研究生与博士后们Andreas Zumbusch, Andreas Volkmer, Jixin Cheng, Eric Potma, Conor Evans, Feruz Ganikhan, Wei Min, Chris Freudiger, Xiaolin Nan, Brian Saar, Maarten Roeffaers, Silvia Carrasco, Dan Fu, Lingjie Kong, Mingbiao Ji,Frank Lu，Wenlong Yang，合作者们Gary Holtom, Yanyi Huang, Peijun Cong, Khanh Kieu, Jing Kang, Frank Wise, Shiyou Ding, Dan Orringer, Meng Wang，Kevin Eggan以及为该领域做出贡献的同事与朋友们；同时对美国太平洋西北实验室、美国能源部、哈佛大学和美国国立卫生研究院对这些工作的资金支持深表感谢。

利益关系声明：

谢晓亮是相干拉曼显微镜公司Invenio Imaging的发起人之一和股东。

参考文献：

1. Maker, P. D. & Terhune, R. W. Phys. Rev. 137, A801–A818 (1965).

2. Hudson, B. J. Chem. Phys. 61, 5461–5463 (1974).

3. Raman, C. V. Indian J. Phys. 2, 237–398 (1928).

4. Woodbury, E. J. & Ng, W. K. Proc. Inst. Radio Eng. 50, 2367 (1962). AQ17

5. Zumbusch, A., Holtom, G. R. & Xie, X. S. Phys. Rev. Lett. 82, 4142–4145 (1999).

6. Duncan, M. D., Reintjes, J. & Manuccia, T. J. Opt. Lett. 7, 350–352 (1982).

7. Freudiger, C. W. et al. Science 322, 1857–1861 (2008).

8. Saar, B. G. et al. Science 330, 1368–1370 (2010).

9. Kieu, K., Saar, B. G., Holtom, G. R., Xie, X. S. & Wise, F. W. Opt. Lett. 34, 2051–2053 (2009).

10. Ji, M. et al. Sci. Transl. Med. 7, 309ra163 (2015).

11. Cheng, J. X. & Xie, X. S. Coherent Raman scattering microscopy (CRC, 2016).

12. Cheng, J. X., Wei, M., Ozeki, Y. & Polli, D. Stimulated Raman Scattering Microscopy: Techniques and Applications (Elsevier, 2021).

13. Xiong, H. et al. Nat. Photonics 13, 412–417 (2019).

14. Bloembergen, N. (Heyden & Son, 1978). Stimulated Raman Effect and Coherent Raman Scattering. In Proceedings of the Sixth International Conference on Raman Spectroscopy, Bangalore, India, 4-9 September 1978: Invited lectures (Vol. 6, p. 335).

15. Thomas GJ Jr. 1999. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28:1–27

原文以25 years of 3D coherent Raman imaging for biomedicine标题发表在2025年5月13日《自然-方法》的评论版块上

Nature Methods

Doi：10.1038/s41592-025-02650-1

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