The Innovation Life | 脉冲式电子照明是否能缓解生物样品的电子辐照损伤？

冷冻电镜可在近天然状态下解析生物大分子的精细结构，极大推动了生命科学和生物医药的发展。虽然该技术已经取得了诸多令人振奋的成果，并持续影响着众多学科领域，但目前限制冷冻电镜分辨率提高的一个重要因素仍然是来自于样品的电子辐照损伤。这是当前冷冻电镜难以突破的技术瓶颈，限制了其原子分辨率的进一步提升。近年来发展的超快电镜技术为解决样品的电子辐照损伤问题带来了新的机遇。用超快脉冲光束驱动的电子脉冲进行成像，将超快电镜技术与冷冻电镜技术结合起来形成的超快冷冻电镜技术，有望在生物大分子复合体的结构动态研究中发挥重要作用，开辟新的研究领域。

近年来出现了有关于“脉冲电子照明可缓解样品电子辐照损伤”的相关报道，但是该“缓解效应”的有效性和正确性在学术界一直存在争议。同时，电子剂量率与样品电子辐照损伤的相关性也一直没有得到系统研究。基于这些科学问题和对冷冻电镜技术突破分辨率瓶颈的深入探索，我们开展了本文的研究工作。

导   读

冷冻电镜凭借解析近天然状态下生物大分子结构的能力，极大推动了生命科学与医药研究的发展，但电子束对生物样品的辐照损伤始终是限制其分辨率提升的主要瓶颈。本文系统探究了脉冲电子照明模式、电子剂量率和温度对生物有机样品电子辐照损伤的影响，并仔细分析了相关物理机制。这些结果为理解生物样品的电子辐照损伤提供了新的见解和实验依据。

图1 图文摘要

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生物冷冻超快电镜（cryo-UEM）

通过将超快激光系统和常规生物冷冻电镜进行改装集成，研究者搭建了可实现脉冲电子照明模式的200 kV生物冷冻超快电镜（cryo-UEM）系统。本研究中，该系统用于研究以饱和脂肪烃晶体（C44H90）为代表的生物有机样品在经时间调制的脉冲电子束下的辐照损伤行为。样品的电子辐照损伤指标由临界电子剂量值（Ne）给出，其定义为：在给定分辨率下，样品衍射强度衰减至初始值1/e（约37%）时所对应的累积电子剂量。作为一个标准化参数，该值已被广泛用于比较评估不同照明模式下样品的辐照损伤敏感性。

图2 C44H90晶体的超快脉冲电子照明实验示意图

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C44H90晶体在常规连续电子照明下的辐照损伤

首先测量了C44H90晶体在常规连续电子照明模式和不同温度下的衍射强度衰减曲线 （图3）。实验结果表明，在同一温度下的不同电子剂量率范围内，C44H90晶体的衍射强度衰减曲线基本相同。由曲线得到的Ne值未表现出与电子剂量率的相关性。这些结果说明，样品在电子束下的辐照损伤并不依赖于电子剂量率，而仅与累积电子剂量相关。

与300 K下的Ne值相比，C44H90晶体在200 K和140 K下的相应Ne值分别增加了约1.61 倍（5.8/3.6）和2.72倍（9.8/3.6），表明低温对样品辐照损伤具有缓解效应。另外，200 K和140 K下的衍射强度衰减曲线相较于300 K呈现出“先缓后快”的衰减特征。研究者认为这种两阶段的衰减形式源于样品在低温下表现出的“潜在剂量（latent dose）”效应（低温下分子冻结导致的分子结构不对电子剂量进行即时响应的效应）。

图3 常规连续电子照明模式下，C44H90晶体在不同温度和电子剂量率的衍射强度衰减曲线

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C44H90晶体在脉冲电子照明（200 kHz）下的辐照损伤

采用建立的实验策略和数据处理方法，进一步系统测量了C44H90晶体在脉冲电子照明模式（200 kHz重复频率）和不同温度下的衍射强度衰减曲线。最终的实验结果表明：无论在多电子包脉冲模式（每脉冲电子数1-8）（图4）还是近单电子包脉冲模式（每脉冲电子数≤1）（图5），测得的衍射强度衰减曲线及临界电子剂量（Ne）值均与常规连续模式下的结果基本相同。多次重复实验证实，这种脉冲照明模式对样品的电子辐照损伤与连续照明模式相同。

图4 多电子包脉冲电子照明模式下，C44H90晶体在不同温度的衍射强度衰减曲线和Ne值

图5 近单电子包脉冲电子照明模式下，C44H90晶体在不同温度的衍射强度衰减曲线和Ne值

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C44H90晶体在脉冲电子照明（100 kHz）下的辐照损伤

为探究更长时间的脉冲间隔是否会导致电子辐照损伤的缓解效应，通过将激光重复频率从200 kHz降至100 kHz（脉冲间隔由5 μs增至10 μs），再次测量了300 K下C44H90晶体在（多电子包和近单电子包）脉冲模式下的衍射强度衰减曲线（图6）。实验结果显示：样品的衰减曲线及Ne值与200 kHz脉冲模式和常规连续模式下的实验结果相比均无显著差异。这表明，调制脉冲电子数或延长脉冲间隔均未缓解生物有机样品的电子辐照损伤，进一步证实与常规连续电子照明模式相比，脉冲电子照明模式对生物样品的电子辐照损伤并无缓解作用。基于这些实验结果，研究者系统分析了生物样品电子辐照损伤涉及的潜在物理机制。

图6 C44H90晶体在100 kHz 激光重复频率和300 K 温度下的衍射强度衰减曲线和Ne值

总结与展望

利用新搭建的生物超快冷冻电镜系统，本文系统研究了生物有机样品在不同照明模式和实验条件下的电子辐照损伤行为。实验结果表明：样品的电子辐照损伤与电子剂量率之间不存在相关性。通过降低温度可以有效缓解样品的电子辐照损伤。但是，脉冲电子照明模式对样品的电子辐照损伤与连续电子照明模式相同。基于这些实验结果，本文进一步探讨了可能导致辐照损伤的物理机制。这些发现颠覆了我们对电子辐照损伤的一些原有认知（特别是关于剂量率和脉冲模式的作用），为理解样品在电子束下的辐照损伤行为提供了新的见解和实验依据，同时也为超快冷冻电镜技术在生命科学领域的应用提供了指导和启示。

责任编辑

潘彦博    Karolinska Institutet

杨   杰    山西白求恩医院