DNA检测的潜在生物传感器：Zr-BTB MOF纳米片

合作单位：Sichuan University

参考文献：Zhang H, Luo B, Peng A, et al. Interaction of Nucleic Acids with Metal-Organic Framework Nanosheets by Fluorescence Spectroscopy and Molecular Dynamics Simulations. ACS Appl Bio Mater. 2022 Jul 18;5(7):3500-3508. doi: 10.1021/acsabm.2c00431.(IF=4.7)

背景：

纳米材料与核酸的相互作用在材料科学中具有重要意义，越来越受到研究者的关注。基于这种亲和相互作用，DNA连接结构可以实现纳米材料结构的可编程和精确组装，以调整其物理和化学性质，如磁性、电子和光学性质。纳米材料对核酸的独特吸附特性也被用于生物分析化学应用，如DNA富集和检测。近年来，各种纳米材料被开发用于DNA提取和生物传感应用。这些DNA生物传感器的检测原理主要基于荧光共振能量转移(FRET)效应和纳米材料对双链DNA (dsDNA)和单链DNA (ssDNA)吸附亲和力的差异一般来说，纳米材料与双链DNA相比，对双链DNA具有更强的亲和力。因此，通过吸附ssDNA过程中的荧光猝灭和dsDNA形成过程中的荧光恢复，可以实现互补靶DNA的荧光检测。该方法具有操作简单、灵敏度高的特点。除了DNA生物传感器外，核酸-物质相互作用在生物医学和生物纳米技术应用中也显示出巨大的潜力，包括体内生物传感、成像治疗、基因和药物传递等。

纳米片由于其超薄的特征和二维结构而具有独特的物理化学性质它们已成为递送、捕获、检测和分析生物分子的新兴纳米材料。到目前为止，各种二维纳米片，如石墨烯、黑磷纳米片(bp)、石墨碳氮化(g-C3N4)和氮化硼(BN)已经得到了广泛的发展。作为新兴的二维纳米材料，金属有机骨架(MOF)纳米片具有规则的孔隙率、较大的比表面积和优异的稳定性此外，由金属团簇和有机配体组成的mof具有丰富的活性位点。与传统的二维纳米材料相比，MOF纳米片具有明显的多孔性能、可定制性、预设结构等优势。特别是MOF纳米片的多孔结构和良好的生物相容性可以为目标生物分子的吸附提供较大的活性比表面积和合适的相互作用微环境。因此，这些独特的物理和化学性质赋予了MOF纳米片在生物分子分析方面的巨大潜力。一般来说，MOF纳米片是通过溶剂辅助剥离法制备的。这种自上而下的策略导致了MOF纳米片的低产量，因为在大量的MOF中存在很强的层间π−π相互作用。因此，设计和制备高产率的MOF纳米片有利于探索其与核酸的相互作用，扩大其在生物分子分析中的应用前景。

一般来说，传统的二维纳米片，如石墨烯、黑磷纳米片和共价有机骨架纳米片，与ssDNA和dsDNA具有不同的亲和力。磷酸主链与核酸和纳米片上的核碱基之间的亲和力是基于非共价键作用力，如范德华力、静电、氢键和π堆叠然而，目前尚不清楚哪种力在影响特定纳米材料的这种相互作用中起关键作用。同时，ssDNA和dsDNA在纳米片表面的结合方式也是不确定的。因此，研究ssDNA和dsDNA与MOF纳米片之间的具体相互作用，如作用力、结合能和结合模式，具有重要的意义和吸引力。

本文报道了一种由1,3,5-苯三苯甲酸酯和Zr−O簇组成的二维Zr- btb MOF纳米片的自下而上合成方法。制备的均匀Zr-BTB MOF纳米片横向尺寸为亚微米，厚度约为10 nm，具有高度暴露的路易斯酸位点和平面多孔结构。超薄的二维结构、固有的MOF性质、高收率和优异的稳定性使Zr-BTB纳米片具有巨大的应用潜力。此外，通过分子动力学模拟和荧光测量，系统地研究了Zr-BTB MOF纳米片与染料标记的ssDNA和dsDNA的相互作用。由于氢键和π−π相互作用，Zr-BTB MOF纳米片与ssDNA的亲和力比dsDNA强得多。作为概念验证应用，获得的Zr-BTB MOF纳米片可以用作DNA检测的荧光传感平台。结果表明，Texas标记的ssDNA可以被吸附在Zr-BTB纳米薄片上。在目标互补DNA存在的情况下，形成的dsDNA会从Zr-BTB MOF纳米片上分离，荧光信号被重新点亮，从而提供对目标DNA的定量分析。本文的目标是在基本水平上研究Zr-BTB MOF纳米片与核酸之间的相互作用，以探索这种材料不仅作为DNA检测的潜在生物传感器，而且作为各种生物医学应用的潜在多功能平台的能力。

方案设计：

为了研究DNA在Zr-BTB纳米结构表面的吸附过程，探索Zr-BTB MOF纳米片与核酸之间的相互作用。通过与魔德科技技术团队沟通，根据客户提供的蛋白信息，采用MD模拟方法分别研究了dsDNA和ssDNA在Zr-BTB材料表面的吸附过程。

主要结果：

Zr-BTB MOF纳米片的表征

以氯化锆为金属离子源，1,3,5-苯三苯甲酸酯为有机配体，采用水热法制备了Zr-BTB MOF纳米片。在此，所制得的Zr-BTB MOF纳米片具有粒径均匀、分散性好、规模大(85 mg)、收率高(50%)等特点。采用透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)研究了ZrBTB MOF纳米片的形貌。如图1所示，Zr-BTB MOF纳米片呈现出横向尺寸约为1.5 μm的类石墨烯(2D)纳米片形貌。快速成核和析出导致了Zr-BTB MOF的二维层状晶体结构的形成。通过原子力显微镜(AFM)表征研究了Zr-BTB MOF纳米片的厚度和形状(图1E)。结果表明，Zr-BTB MOF纳米片形貌均匀，厚度约为10 nm，宽高比约为150；上述结果清楚地证明了Zr-BTB MOF纳米片的二维层状结构和纳米片形貌，表明非均质条件可以在良好的动力学条件下将MOF产物锁定在中间阶段，从而导致纳米片的高效形成。

为了确认MOF结构的固有性质，对ZrBTB MOF纳米片进行了氮吸附-解吸等温线测量和粉末x射线衍射(PXRD)。采用氮吸附-脱附等温线测量了所制得的Zr-BTB MOF纳米片的固有孔隙率和比表面积。如图1F所示，不规则填充物的晶体结构和间隙孔洞使Zr-BTB MOF纳米片具有微孔(1.6 nm)和介孔(2.6 nm)。纳米片的不规则排列通常会产生间隙空洞。因此，ZrBTB MOF纳米片的介孔结构可能源于MOF纳米片不规则堆积形成的间隙空洞。由于随机堆叠的性质，Zr-BTB MOF纳米片的表面积(241 m2 g−1)远小于Zr-BTB MOF块体的表面积(613 m2 g−1)总的来说，得到的Zr-BTB MOF纳米片保持了大比表面积和多孔性的MOF特性。在PXRD表征方面，与块体Zr-BTB MOF相比，Zr-BTB MOF纳米片的结晶度较低，代表穿间结构的晶面峰(220)消失(图2A) 32由于单层纳米片的无序堆叠特性，导致制备的纳米片结晶度较低。同时，穿透间结构的消失意味着二维层状结构的成功制备。

图1. Zr-BTB MOF纳米片SEM显微图(A, B)；Zr-BTB MOF纳米片的TEM显微图(C, D)；利用原子力显微镜表征Zr-BTB MOF纳米片的形貌(E)；Zr-BTB MOF纳米片的N2吸附-解吸等温线和孔径分布(F)

成分分析纳米片通过X射线光电子进一步进行光谱学（XPS），傅里叶变换红外光谱学（FTIR）和热重分析（TGA）。如图 2B 所示，FTIR 特性在 546 和 456 cm 处达到峰值，表明Zr-BTB MOF结构的Zr-O簇成功形成。此外，C、O和Zr元素的存在表明了所制备的Zr-BTB MOF的基本组成纳米片 (图2C）。随着残留试剂和物理吸附水的蒸发，Zr-BTB MOF的质量纳米片降低约5%，直到温度达到400°C（图2D）。同时，TGA分析证明，Zr-BTB MOF纳米片具有高达400°C的热稳定性。高分解温度进一步证明了Zr-BTB MOF结构固有的热稳定性。

图2. (A) Zr-BTB MOF纳米片的XRD谱图；(B) Zr-BTB MOF纳米片的FTIR光谱；(C) Zr-BTB MOF纳米片的高分辨率XPS；(D) Zr-BTB MOF纳米片的TGA曲线

由于纳米材料在反应缓冲液中的分散性和稳定性对于核酸酸纳米材料相互作用，Zr-BTB MOF的分散性和稳定性纳米片研究了PBS缓冲液中形成的悬浮液。在预定时间点获得静态放置悬浮液的光学照片和紫外吸收光谱。如图3所示，73.4%的Zr-BTB MOF纳米片6小时后仍悬浮在溶液中。直到48h后，溶液中的纳米片才全部沉淀下来。因此，Zr-BTB MOF纳米片在溶液中具有良好的分散性能和稳定性。

图3. ZrBTB MOF纳米片在PBS缓冲液中储存0、3、6、12、24和48 h后的光学照片和吸收光谱

通过分子动力学模拟，可以分析ZrBTB MOF纳米片对ssDNA和dsDNA的吸附过程，从而获得具体相互作用的详细信息。同时，荧光实验验证了Zr-BTB MOF纳米片对ssDNA和dsDNA的实际吸附性能。因此，本文通过分子动力学模拟和荧光测量，明确了Zr-BTB MOF纳米片与荧光团标记的ssDNA和dsDNA的相互作用差异

分子的动力学模拟

首先研究了Zr-BTB MOF对 ssDNA 和 dsDNA 的吸附过程纳米片由分子的动力学模拟。双螺旋结构中的互补碱基配对没有明显变化，DNA仍保持螺旋结构。在ssDNA体系中，由于ssDNA的碱基没有互补配对，因此在100 ns MD后，ssDNA的结构发生了显著变化模拟，螺旋结构也消失了。另外，分析了两个系统在MD模拟过程中的回转半径（Rg）和均方根差（RMSD）变化。可以发现dsDNA的结构在模拟过程中是稳定的。然而，ssDNA的结构在模拟过程中会出现波动，这可能导致结合模式和亲和力的差异互动。然后，进一步分析了MD模拟过程中dsDNA和ssDNA与材料表面的距离。dsDNA（1.715±0.038 nm）与材料表面之间的质心距离大于ssDNA（1.479±0.042 nm）。结果表明，ssDNA和Zr-BTB的质心明显更接近，表明ssDNA在材料表面的吸附比dsDNA更紧密。

为了研究在模拟过程中DNA与材料之间的特定相互作用，氢键和π-π相互作用分别分析。可以发现，dsDNA与Zr-BTB MOF纳米片之间的氢键相对较弱，50 ns后的平均值为1.39。然而，ssDNA与Zr-BTB MOF纳米片之间的氢键明显更强，平均为2.46。可以看出，dsDNA与Zr-BTB MOF纳米片表面的π−π相互作用明显弱于ssDNA。同时，本文还分析了模拟过程中结合能的变化。在模拟过程中，dsDNA体系的库仑力逐渐增大，在50ns后趋于稳定，平均值为-127.50±34.61 kJ/mol。然而，ssDNA与Zr-BTB MOF纳米片的结合能明显强于dsDNA，其库仑效应为-273.82±43.15 kJ/mol。结果表明，库仑力的贡献是ssDNA与Zr-BTB MOF纳米片结合的重要驱动力。

经过MD模拟进一步分析。如图4A所示，dsDNA仍然保持着相对稳定的双螺旋结构。在ssDNA体系中，单链DNA的磷酸主链明显扭曲(图4C)。在Zr-BTB MOF纳米片的中心周围，磷酸主链不仅可以与水分子和羟基形成氢键，而且碱基部分也可以形成氢键(图4D)。此外，ssDNA结构中的一些基面与材料表面的苯环基本垂直，可以形成较强的π−π相互作用。综上所述，ssDNA和dsDNA结构导致的氢键和π−π相互作用的差异是Zr-BTB MOF纳米片吸附性能差异的主要原因。

图4. dsDNA（A，B）和ssDNA（C，D）在Zr-BTB MOF表面的结合模式纳米片MD后模拟（绿色虚线表示氢键）

结论：

综上所述，通过自下而上的合成方法制备了一类超薄的二维MOF纳米片，命名为Zr-BTB MOF纳米片。得到的Zr-BTB MOF纳米片形貌均匀，厚度约为10 nm，宽高比高。通过系统分子动力学模拟和荧光光谱分析，深入研究了DNA与Zr-BTB MOF纳米片的相互作用。动态吸附过程的结果表明，氢键和π−π相互作用是ZrBTB MOF纳米片吸附ssDNA和dsDNA差异的关键因素。由于ssDNA与dsDNA吸附的差异，Zr-BTB MOF纳米片可用于互补靶ssDNA检测。作为概念验证应用，Zr-BTB MOF纳米片成功用于靶DNA检测，并表现出良好的线性和相当的灵敏度，显示出作为DNA检测生物传感器的巨大潜力。重要的是，这些发现揭示了这些材料在生物医学领域的前景和多功能特性，特别是它们在先进DNA传感系统和核酸控制递送方面的潜在应用。