组织创伤修复新技术：细胞重编程促进伤口愈合

皮肤是一个由多种组织构成的复杂器官，构成皮肤的各种组织相互协调，保护皮肤免受日常磨损和有害微生物的侵害，发挥皮肤的感觉、吸收、分泌和排泄、调节体温、代谢等功能。因此，当皮肤屏障受到创伤时需要各种细胞类型、信号因子和基质协调作用才能重建组织完整性并恢复皮肤功能。

表皮由基底层的干细胞不断更新、修复。皮肤创伤愈合的一个关键步骤是周围组织的角质形成细胞迁移到伤口处，促进再表皮化。但对于大面积的创伤，这个过程效率极低。对于创面修复一直是世界性的科学问题，创面不愈或难愈的发的生率正在逐年增高。为了更好的医治患者，因此，开发一种快速有效再生表皮的方法是必要的。

最近，美国索尔克生物研究所的Juan Carlos Izpisua Belmonte教授及团队在《Nature》上发表了题目为“In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skinepithelial tissue” 的研究论文，该研究通过转导四种皮肤细胞谱系的转录因子，将伤口驻留的间质细胞重编程为上皮组织，可以使小鼠皮肤溃疡表面快速有效的上皮化，其研究结果可能为治疗皮肤伤口提供了一种新的治疗途径。于是，本期生命树之谜，小编将这篇精彩的文献分享给大家，共同学习！

1

DGTM因子为重编程的最佳组合

首先，研究人员首先通过比较人角质形成细胞细胞(human keratinocytes )和人原代真皮成纤维细胞(primary hDFs, primary human dermal fibroblasts)的基因表达差异，找到可能参与细胞角化过程的55个转录因子和31个microRNAs。经过进一步验证和筛选，终于确定了其中28个转录因子可以在体外诱导产生角化细胞样的细胞。同时，通过3D类器官培养发现，这些细胞可以形成复层上皮，并将其命名为28TF-iSEPs。

为排除角化细胞在细胞分离过程受污染的可能性，研究人员利用脂肪间充质干细胞(hADSCs, human adipose-derived stromal cells)进行下一步研究。通过逆转录病毒来提高转染效率并降低细胞毒性，并对28个转录因子进行排除冗余筛选，结果发现；（1）DNP63A和GRHL2可以使hADSCs重编程为类似28TF-iSEPs的细胞，（2）MYC可以提高重编程效率、细胞增值能力并促进表皮分层，（3）TFAP2A可以加快细胞克隆的出现。最终确定了重编程的最佳组合为：DNP63A、GRHL2、TFAP2A 和MYC(简称DGTM因子)。值得注意的是，这些体外诱导产生的表皮细胞角化程度不足，在基底上层细胞中表达角质素13而非角质素10。由于表皮细胞受周围环境的影响，因此研究人员推测DGTM因子在体内能更有效的诱导皮肤样上皮组织的产生（图1）。

图1.DGTM因子为重编程的最佳组合

2

DGTM因子在体内能效的诱导产生皮肤样上皮组织

为了验证这种细胞重编程技术可以在体内从皮肤溃疡表面重新诱导产生新的上皮组织。研究人员在小鼠身上模拟了一种隔离性皮肤溃疡的方法，使创伤中心部分形成皮肤溃疡，防止周围的角质形成细胞进入伤口从而产生难以愈合的溃疡。通过腺病毒系统将DGTM导入基因型为Krt14 cre 、LSLtdTomato的小鼠来观察上皮再生情况。在第18天后，伤口溃疡处观察到了上皮样组织；28天后，这些新的上皮组织与伤口周围的皮肤在组织学上非常相似。而在没有任何处理的对照组，伤口溃疡组织并不能上皮化（图2）。

图2. DGTM因子诱导体内重编程生成上皮组织

为了进一步研究DGTM中每个因子在重编程间质细胞到上皮细胞过程中的作用，研究人员检测了不同组合的腺病毒，发现DNP63A在重编程过程中必不可少，GTM因子与DNP63A协同作用以产生上皮组织。 值得注意的是，致癌基因MYC对于从头生成上皮组织是不必要的。研究还发现，DGTM诱导产生的上皮细胞有着与正常皮肤相似的再生潜力，和正常皮肤一样可以抵抗外界环境的刺激并具有屏障功能，如在伤口微环境内成熟足够长的时间，还表现出正常皮肤的组织学特征（图3）。

图3.DGTM因子协同产生上皮组织

为了确定DGTM诱导生成的上皮细胞是否能在较长时间内维持，以及是否能促进伤口愈合。研究者使老鼠两次创伤，在小面积皮肤溃疡内产生上皮组织后，再此基础上制造较大面积的皮肤溃疡，发现还能再次形成大面积的上皮组织，而且新生成的组织与周围的表皮相连接，同时保持分层的上皮结构（图4）。

图4. 生成的上皮组织使伤口愈合

3

DGTM诱导生成的上皮组织学特征和功能屏障特性

为了比较生成的上皮组织特性，在不同时间点收集样本，通过免疫组织化学分析发现，新生成的上皮组织与正常皮肤相似，上皮组织形成一个角化的包膜，并在最表层表达兜甲蛋白。根据基底上层表达角蛋白不同，新生成的上皮细胞可分为三种类型：K10+K13-,K10+K13+和K10-K13+,K10在自然皮肤表皮中表达，K13在粘膜上皮和高增殖表皮中表达。刚生成的上皮组织有散在K13表达，没有或少量K10表达，但这种表达逐渐向K10-K13+方向移动，更接近自然表皮角蛋白类型，随着时间的延长DGTM诱导生成的上皮组织就具有正常皮肤的组织学特征。另外，皮肤最重要的功能之一就是能够作为抵御外界环境的屏障。为了评价DGTM诱导产生的上皮细胞的屏障功能，采用甲苯胺蓝染料渗实验发现，与周围正常的皮肤相似，DGTM诱导产生的上皮组织能够有效地阻断了染料的渗透，说明DGTM诱导产生的上皮细胞具有良好的屏障功能（图5）。

图5.DGTM诱导生成的上皮组织学特征和功能屏障特性

为了评估该技术的临床运用价值，研究人员在腔室模型中研究显示DGTM-AAV对伤口的血管分布没有显著影响。为了提高这种潜在治疗技术的临床运用，研究人员将GFP-AAV溶液与等量的胶原凝胶混合，可以增加AAV系统的效能和特异性；通过添加生物活性分子，例如FGF2和Rock，可以进一步改善DGTM-AAV的有效性。因此，这两个因子与胶原支架组合，极大地增强了体内重编程效率，导致伤口不同区域伴随产生新生上皮，最终加快伤口愈合速度。

总结与展望

本研究通过比较人角化细胞和人真皮成纤维细胞基因表达差异，通过验证和筛选，终于确定28个转录因子可以在体外参与诱导产生角化细胞，并对这28个因子进行排除冗余筛选确定了重编程的最佳组合--DGTM因子，并且进一步在小鼠体内验证了，这种细胞重编程技术可以在体内将伤口驻留的间质细胞转变为新的上皮组织，并且与正常的皮肤一样具有较好的屏障作用，能够抵御外界不良环境。为了提高这种潜在治疗的临床运用，研究人员将GFP-AAV溶液结合生物材料胶原凝胶，进一步增加AAV系统的效能和特异性，通过添加生物活性分子FGF2和Rock能够加快伤口愈合速度，具有较大的临床运用价值。

然而，DGTM因子诱导伤口驻留的间充质细胞进行重编程，使得伤口区域能够重新上皮化。在这种具有潜在变革性的运用非手术技术修复皮肤创伤的方法在临床应用之前，还有很多问题亟待解决，如包括提高重编程效率以更快地形成上皮，优化基因递送方法，以及对于递送系统靶向性的改进，还必须进行长期安全性研究，以评估靶向效应和致瘤潜力，特别是因为DNP63A是潜在的致癌基因。该系统还必须使用更多临床相关动物模型进行测试。伤口的炎症状态或患者的其他临床特征均可能影响重编程效果，仍需要进一步改进，进而为今后临床运用打下基础。

参考资料；

Elaine Fuchset al,. Skin and Its Regenerative Powers: An Alliance between Stem Cells and Their Niche. 2017,43(4): 387–401

欢迎订阅！

生命树之谜：

中国科学院动物研究所生殖病理学研究组

BOSS简介：

http://sourcedb.ioz.cas.cn/zw/zjrc/200907/t20090716_2088415.html

Lab简介：

http://rpb.ioz.cas.cn/yjz/wangyanling/