文献解读—mSphere：又双叒叕出新ITS1引物了！

这几天在微生物生态公众号看到了几篇比较相关的文章，但是介绍的比较简单，我挑出来感兴趣的再mark一下。

下面这一段来自于微生物生态公众号：

mSphere是美国微生物协会(ASM)的新刊，收录的主要研究方向包括：

·Applied and Environmental Science

·Clinical Science and Epidemiology

·Ecological and Evolutionary Science

·Host-Microbe Biology

·Molecular Biology and Physiology

·Therapeutics and Prevention

ASM旗下比较著名的杂志还有AEM，mBio等。

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Novel ITS1 Fungal Primers forCharacterizationof the Mycobiome [1]

文章思路

1. 收集引物

收集已经广泛使用的ITS1区引物（5正向4反向）如Table S1所示。

2.建立数据库

由于现在还没有针对ITS1区的数据库，作者结合了Silva和Unite数据库建立了SIS(18S-ITS-5.8S)数据库。SIS数据库包含5,789个模拟的参考序列contigs，涵盖了3,842个真菌物种。利用SIS数据库设计了85个引物(78个正向7个反向)(Fig.1)。设计时采用18S区域3’最后的250bp进行设计，保证扩增得到的序列紧挨着ITS1上游。

3.引物筛选

两个标准对引物进行筛选：对UNITE数据库真菌物种具有高覆盖度；正、反向引物的Tm

4.引物评价

经过计算模拟、纯培养真菌的测序、临床样本测序，得到的最优引物为ITS1-30F/ITS1-217R。

ITS1-30F (5’-GTCCCTGCCCTTTGTACACA-3’)

ITS1-217R (5’-TTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3’)

新引物能够提升真菌分类的覆盖度、真菌读长的重现性与人类相关真菌群落的准确性。

结论

In silicoanalyses

对于正向引物，新引物的覆盖度完爆以前的引物。对于反向引物，ITS1-217R (N)与ITS2(L)都具有很高的覆盖度（Fig.2）。可能的原因是5.8S区域保守度高，反向引物效果差别不大。而18S区域较长且可变性更高，正向引物之间效果差别较大。

Fig 2 利用PrimerProspector评价引物的覆盖度。

Testing offungal cultures

挑选出属于子囊菌门和担子菌门的13种阴道常见菌进行测序。结果表明新引物能得到更深的测序深度、读长一致性(consistent read recovery)更好、对物种的鉴定能力更强。

1) 测序深度：新引物平均测序深度21,830±225 fungal reads, 之前引物平均测序深度3,305±1,621 fungal reads (P= 0.029).

2) 鉴定能力：效果最差的是ITS1-F(L)，13种真菌鉴定出10种。其次是ITS1 (L) 和ITS5 (L)能鉴定出11种。This misidentification occurred for cultures when the primers had less than 1,000 reads, highlighting the importance of adequate sample sequencing depth。引物小于1000 reads是什么意思没看懂。。。

几点思考

1. 由于作者自己设计SIS数据库进行模拟实验，数据库可能存在不完全的问题，另外计算模拟(in silico)的方法会带来不可预知的误差。

2. 13种可培养的真菌仅选择阴道常见菌，这些菌在人体其它部位含量很低。另外临床样本也是从阴道与肛门取样所得。且作者明确指出新设计的引物主要针对人体真菌的研究：These primers should facilitate thestudy of fungi in human physiology and disease states。因此对于该引物应用到其他环境还需要慎重考虑。

3. 为什么要设计针对ITS1区的引物，作者认为ITS1区具有广泛的覆盖度，可以在种水平准确检测出真菌物种 （“region of the eukaryotic ribosomal cluster has features allowing for wide taxonomic coverage and hasbeen recognized as a suitable barcode region for species-level identificationof fungal organisms”）。结合之前分享过的一篇文章文献解读—AEM：通过改良Illumina扩增子测序的种系特异性引物准确检测真菌群落多样性与丰度，文中提到SSU3’端最后部分存在一个内含子插入区(intron insertion site)，该内含子易于得到、丢失和突变（Fig.3）。已经发现内含子在多种子囊菌门(Ascomycota)中广泛存在，最长可达400bp[2]。使用ITS1F等引物扩增的ITS1区时，内含子的存在会显著增加扩增的长度，给Illumina测序带来困难。而本文并未提到内含子的问题，我推测他们这种方法应该解决了内含子的问题。原因基于以下两点：本文选择了SSU（即18S）3’端最后的250bp来设计引物保证扩增区紧挨ITS1区上游，可能会避开内含子；对13种真菌测序的研究表明新引物对子囊菌的检测效果也很好，可能扩增的片段中不含内含子区域。

Fig 3 左上三角区为内含子

参考文献

1.Usyk, M., et al., Novel ITS1Fungal Primers for Characterization of the Mycobiome. mSphere, 2017. 2(6).

2.Taylor, D.L., et al., AccurateEstimation of Fungal Diversityand Abundance through Improved Lineage-SpecificPrimers Optimized for IlluminaAmplicon Sequencing. Applied andEnvironmental Microbiology, 2016. 82(24):p.7217-7226.

一个环境工程专业却做生信分析的深井冰博士，深受拖延症的困扰。想给自己一点压力，争取能够不定期分享学到的生信小技能，亦或看文献过程中的一些笔记与小收获，记录生活中的杂七杂八。