这些qPCR引物设计的骚操作,你造么?

三步搞定引物设计,就是这么牛!

在《酸谈实验室》课程中,猫大老师就曾详细介绍了利用OLIGO、DNAMAN等软件进行PCR引物设计的具体方法,虽然这些软件实操起来切实可行,但这些软件的获取安装甚是繁琐复杂,着实给研究者带了一定的麻烦。今天小编我就想介绍一些可华丽丽的无视软件下载过程的骚操作,可简单粗暴进行qPCR引物设计。

常规操作之检索CDS序列

第一步还是检索CDS区的序列,猫大老师曾在课程中介绍了利用NCBI数据库寻找CDS序列,但其实利用UCSC数据库也能找到CDS序列,而且UCSC数据库还会有一个额外的好处,在此先卖个关子,后续内容会再提到。

进入之后可在左边选择物种,在右边方框中输入基因名称。以人的E2F1基因为例,点击GO;

在打开的页面中选择需要的变体,点击进入;

点击红圈所指位置;

出现一个新的页面:

在该页面下方,点击红圈中的序号:

在新出现的页面中点击红圈位置;

即可得到结果,其中红色区域为UTR区,蓝色区域即为CDS区,其中每一个外显子的第一个碱基以及最后一个碱基都用橙色/浅蓝色标出了,这为我们下一步设计引物提供了方便。

我们将序列复制粘贴到Word文档中,为了方便起见,用Word中的替换稍作处理:在“查找内容”中输入“^#”,代表任意数字,“替换为”内容为空白,即可将所有数字删除;

骚操作之qPCR引物设计

虽然引物设计原则是老生常谈,但确实是重中之重,各位小伙伴还是得对其做到了如指掌。除了要在CDS区(即蓝色区域)进行引物设计,以下几个方面也是需要认真考虑的。

1. 引物长度在17-25bp之间

2. 引物最后一个碱基不要A或者T

3. CG不要太多

4. 避免过多重复序列,如AAAAA、CCCCC等

5. 定量产物长度200bp左右(不是太严格)

6. 至少跨越一个外显子设计引物(避免Trizol抽提的RNA中混有的基因组DNA也被扩增出来;这里用UCSC检索CDS区的优势就显现出来了,用NCBI是看不到外显子和外显子的分隔的)

那么依据上述原则,即可选一个满足上述条件的上游引物:

随后在距上游引物200bp左右处选择基本符合条件的下游引物,值得注意的是下游引物与所选择的序列是方向互补的。

如此即可获得一对qPCR的上下游引物:

上游引物:TCGCAGATCGTCATCATCTC

下游引物:GCCAGGTACTGATGGTCAG

当然,如果说以上方法比较考验人的眼力,那么以下两个网址可谓是设计qPCR引物的良心网站。其操作方法非常简单,依据实验需要设计相应参数后,黏贴相应序列,进行检索设计即可。

1)GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design:

网址:https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer#

2)Pick primers from a DNA sequence

网址:http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi

常规操作之Primer-Blast比对引物特异性

打开NCBI,进入Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi):

点击进入如下界面:

选择相应的物种和参考数据库

选好后点击Get Primers,一段时间后进入如下页面:

由结果可知,设计的引物Tm值相近,符合要求,但是有一个非特异性结果,有可能会导致非特异性扩增。

以上这些方法虽然简单粗暴,但是也基本上能满足多数时候的需要,如果你只是偶尔需要设计一两条引物,那么可以试试这些方法哦。

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  • 原文链接https://kuaibao.qq.com/s/20180907G13Z6N00?refer=cp_1026
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