医学生物信息学文献第2期：肿瘤微环境

肿瘤内刺激树突状细胞(SDC)在刺激细胞毒性T细胞和诱导抗肿瘤免疫反应中起着重要的作用。 了解调节它们在肿瘤微环境(TME)中的丰度的机制可以揭示新的治疗机会。作者发现，在人黑色素瘤中，SDC的丰度与细胞因子FLT3LG基因的瘤内表达有关。FLT3LG主要由淋巴细胞产生，尤其是小鼠和人类肿瘤中的自然杀伤(NK)细胞。在小鼠TME中，NK细胞与SDC形成稳定的结合，小鼠NK细胞的遗传和细胞消融表明：FLT3L的产生在调节肿瘤中SDC的丰度方面发挥重要作用。虽然抗PD-1‘检查点’免疫疗法主要以T细胞为靶点，但作者发现NK细胞频率与人肿瘤中保护性SDC、患者对抗PD-1免疫治疗的反应性以及提高总体生存率有关。作者的研究表明，固有免疫SDC和NK细胞共同作为T细胞定向免疫治疗的良好预后工具，这些固有细胞是增强T细胞肿瘤反应所必需的，表明这一轴是新疗法的靶点。

人类中分别由整合素CD103和血栓调节蛋白(BDCA-3，又称CD141)的表达确定。 肺的研究表明，这些细胞在肿瘤中比在邻近的正常组织中更少。 在黑色素瘤中不常见的WNT-β-catenin通路突变病例中，这些DC数量的减少与预后不良有关，也与肿瘤中趋化因子表达模式的缺陷有关。 在这里，作者发现sdc数与预后不良之间的关系可能更加普遍。在本研究中，作者发现TME中BDCA-3+SDC的保护水平与黑色素瘤患者较好的总生存期(OS)相关。作者进一步将肿瘤内SDC的数量与FMS相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3LG)的基因表达联系起来，FLT3LG是cDC 1的形成性细胞因子。 作者利用一种新型的Flt 31报告小鼠，将肿瘤内淋巴细胞鉴定为肿瘤中Flt 31的产生者，其遗传学和功能研究表明，自然杀伤(NK)细胞是产生Flt 31以控制肿瘤中SDC水平的完整细胞类型。 作者进一步证明，人黑色素瘤中的SDC与肿瘤内NK细胞的水平有关，并且这两种固有免疫细胞类型与抗PD-1免疫治疗的反应性相关。 这些结果表明，NK细胞通过在肿瘤中产生FLT3LG，控制肿瘤中SDC的水平，提高患者对抗PD-1免疫治疗的反应性。

研究思路：

1、人黑色素瘤中BDCA-3+ SDC水平与整体存活率的提高相关。

我们之前的工作发现了8个基因的“SDC标签”，它来源于SDC与小鼠肿瘤内所有其他髓系群体的直接比较(图1A)。 我们使用这种SDC基因标签来评估黑色素瘤样本谱中与转移性黑素瘤数据相关的临床结果数据的SDC数目，并发现六个“SDC标签”基因从转移时起就与增加的OS有显著的个体关联(补充表1)。 此外，在Kaplan-Meier分析中，我们将每个样本的整个标签以66%的严格度分为“高”或“低”表达，我们发现高表达与OS的增加显著相关(Fig. 1b)；在33%和50%的严格度下观察到类似的相关性(补充图1A)。 肿瘤基因组图谱(TCGA)黑色素瘤数据集(补充图)中概述了SDC基因标签与OS增加的相关性 (Supplementary Fig. 1b)。进一步发现肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)类型的层组与SDC基因标签高度相关（Fig.1C） 。 此外，使用SDC和非刺激髓样细胞(NSMs)特征比值的基因标记的表达(代表刺激和抑制性髓细胞群体的相对丰富度)也显示与OS和T细胞浸润增加有很强的相关性(补充图1C-E)。 这些数据表明，肿瘤中SDC的相对水平与OS的增加有关。

2、瘤内SDC丰度预示抗PD-1免疫治疗的反应性。

肿瘤SDC最初被定义为具有向T细胞交叉呈现肿瘤抗原并刺激T细胞的能力，并在小鼠模型中被证明是产生较好的抗PD-1反应所必需的。 因此，我们寻求确定SDC水平是否与T细胞检查点阻断剂治疗的有效性有关，预计该治疗将可能释放更多的CD8+T细胞控制肿瘤。 为了将这一分析扩展到黑色素瘤患者，并更广泛地确定抗PD-1免疫治疗反应所需的免疫成分，我们分析了两组独立的活组织切片或转移性黑色素瘤患者手术切除的肿瘤活检(组A：n=33，包括已经接受各种免疫治疗的患者；组B：n=23，都是抗PD-1免疫治疗前的；补充表2)。 活组织切片消化成单细胞悬液，随后用流式细胞术和RNA测序(rna-seq)进行分析，同时跟踪患者的临床结果以及抗PD-1免疫治疗的反应性。 患者被分为“无应答者”组，定义为病情稳定或进展的组，或“应答者”组，定义为对抗PD-1治疗有部分或完全应答者(见方法)。 我们设计了一个全面的流动面板来定量人体肿瘤中的免疫浸润(Fig. 1d–f and Supplementary Fig. 2a,b)，虽然我们发现黑色素瘤患者免疫浸润的数量存在异质性，但总免疫浸润与抗PD-1免疫治疗的反应性之间没有明显的相关性(图1D)。

相反，TME内的多个髓细胞系倾向于对免疫治疗有反应 (Fig. 1e,f)。 CD14（-）肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)在抗PD-1治疗反应患者中呈增加趋势，但这仅见于一个群组(图1E)。 B组中CD14+细胞数量高对抗pd-1免疫治疗的响应有不好的预后，而在组A中，CD14+CD16+单核细胞可以有效地从CD14+CD16 - TAMs中分离出来，肿瘤内单核细胞水平升高，比TAMS更明显，对抗PD-1免疫治疗有负的预后价值(图1e)。 此外，BDCA-1+DC(CDC2s)在2个群组中均未显示与应答者状态相关的显著变化 (Fig. 1f)。有趣的是，在总抗原呈递细胞（APCs; gating on CD19–HLA-DR+ cells）中，BDCA- 3+ DCs（通过CLEC9a染色进一步证实哪些是cDC1）的高比例强烈预测了两组黑素瘤患者对抗pd -1治疗的反应的高比例强烈预测了黑色素瘤患者对抗pd-1治疗的反应(Fig. 1f)

3、FLT3LG表达与肿瘤中SDC水平相关

鉴于SDC与患者预后和抗PD-1免疫治疗反应性有很深的关联，我们寻求确定控制肿瘤中保护性骨髓细胞水平的细胞和分子机制。 包括肿瘤SDC在内的cDC1s形成的细胞因子是FLT3L，但这种细胞因子在肿瘤中的内源性来源尚不清楚。 利用他们的黑色素瘤数据集（包含来自肿瘤活细胞总数的配对流式细胞术和RNA-seq数据）(组A；补充表2)，我们发现在肿瘤中BDCA-3+DC水平与FLT3LG的表达显著相关(图 1g)。 我们证实了肿瘤中SDC水平与FLT3LG表达之间的这种相关性，利用SDC基因标签来估计公开的TCGA黑色素瘤数据集中的SDC水平。 FLT3LG高表达(中位分裂)的TCGA黑色素瘤样本明显增加OS，这与FLT3LG在肿瘤SDC控制中的重要作用一致。 这些发现表明，控制tme中的细胞因子flt3lg可以对sdc的水平产生重要影响，sdc是一种对癌症免疫反应和抗pd-1免疫治疗反应非常重要的细胞类型。

4、淋巴细胞是肿瘤微环境中FLT3L的主要来源

肿瘤中FLT3LG表达与SDC水平的相关性，引出了哪个细胞类型产生FLT3L的问题。因此，我们在内源性小鼠Flt3l位点下游引入可诱导的编码Cre和teal荧光蛋白(TFP)的DNA，从而获得了Flt3l-报告小鼠(Fig. 2a)。携带与此等位基因纯合的异位B16F10肿瘤的小鼠，尽管血清总FLT3L有少量但可重复的下降，但其在TME中的常规DC和淋巴细胞比例相似，这表明该蛋白在肿瘤中有类似的功能(补充 Fig. 3a–c)。Flt3l-纯合报告小鼠注射异常的B16F10肿瘤，在肿瘤移植后2周，TFP作为Flt3l表达的读数，仅在淋巴细胞内检测到(Fig. 2b,c)。在表达Flt3l的淋巴细胞中，NK细胞表达量最高，T细胞表达量较低，B细胞表达量不高（ Fig. 2b,c; Fig. 3e,f)）。当用抗flt3l抗体检测细胞表面的蛋白时，这些细胞群呈阳性(图2d)。从肿瘤、肿瘤引流淋巴结(LN)和非肿瘤引流淋巴结(LN)分离的NK细胞中，Flt3l的表达水平与TFP的表达水平相似，表明Flt3l的表达不受TME的调节(Supplementary Fig. 3d)。在其他肿瘤模型中也发现了类似的报告等位基因表达模式，包括自发产生的肿瘤模型(例如，多瘤中T抗原乳腺癌模型，其目的是表达mCherry和卵清蛋白(PyMTChOVA)；Supplementary Fig. 4a,b)。有趣的是，野生型(WT)携带b16f10肿瘤动物血清中FLt3L水平没有显著差异，表明局部产生的flt3L对sdc水平和预防癌症很重要(Supplementary Fig. 4c)。

5、肿瘤中淋巴细胞产生FLT3L对于正常的SDC水平是必须的

接下来，我们在小鼠身上进行了基因实验，以检测淋巴细胞及其亚群在控制TME中SDC水平中的作用。对缺乏T细胞和NK细胞的IL2RG-/-小鼠(补充图5a)注射异常的B16F10黑色素瘤，分析肿瘤中髓系细胞和淋巴系细胞的水平。虽然来自IL2RG-/-小鼠的B16F10肿瘤的肿瘤面积与其WT对照组大致相同，但是IL2RG-/-动物肿瘤可显著降低TME中CD 103+SDC的表达，而CD11b+DC的频率无明显变化(图3a和补充图5a)。为了检测淋巴细胞特异性地产生FLT3L在控制SDC水平中的作用，我们将IL2RG-/-骨髓与WT或Flt3l-/-混合骨髓移植到致死性照射的Flt 31-/-受体动物体内，形成混合骨髓嵌合体(图3b)。在肿瘤中与能产生FLT3L的淋巴细胞间隔的IL2RG-/-：WT混合骨髓嵌合体相比，其淋巴细胞室不能产生FLT3L的IL2RG-/-：Flt3l-/-，CD 103+SDC的水平降低(图3b)。肿瘤中CD 103+SDC水平的差异并不是由于T细胞或NK细胞的整体缺失所致，而是丰富的肿瘤引流和非引流LN的IL2RG-/-：Flt3l-/-骨髓嵌合体(补充图5b)。与IL2RG-/：WT-混合骨髓嵌合体相比，IL2RG-/：Flt3l-/-混合骨髓嵌合体的CD11b+DC无明显减少(图3b)；此外，在肿瘤引流和非引流皮肤LN中，居住或迁移的CD11b+DC均无缺陷，提示IL2RG-/：Flt3l-/-混合骨髓嵌合体中CD11b+DC无整体缺陷(补充图5c)。有趣的是，在IL2RG-/：Flt3l-/-骨髓嵌合体中，肿瘤引流和非引流LN中常驻CD8+DC和迁移CD 103+DC的水平也降低，提示淋巴细胞的需求更广泛地延伸到cDC1的产生(补充图5c)

6、NK细胞，而不是T细胞，控制着肿瘤中SDC的丰度。

为了直接检测特定类型淋巴细胞在肿瘤中控制CD 103+SDC水平的作用，在小鼠B16F10黑色素瘤模型中，我们敲出了表达Flt3l报告基因的T细胞和NK细胞。由于重组激活基因(Rag)突变而缺乏所有T细胞的小鼠其肿瘤组织中CD103+DC水平没有减少(图3c和补充图5d)。此外，通过抗体消耗CD4+或CD8+T细胞的WT小鼠也表现出正常的SDC细胞密度（数据未显示)。为了探讨NK细胞的作用，小鼠在B16F10肿瘤注射前3天开始每3天用抗NK1.1抗体治疗一次，结果导致了NK细胞的大量丧失，但淋巴细胞的其他变化和肿瘤生长受限(补充图5e)。而缺乏NK细胞的小鼠TME中CD 103+SDC的频率降低，CD11b+DC的水平无明显变化(图3d)。与我们以前的发现一致，肿瘤中的T细胞刺激依赖于肿瘤内的CD 103+DC，缺乏NK细胞的小鼠肿瘤中活化的T细胞数量有减少的趋势。(补充图5e)。有趣的是，NK细胞的耗竭导致CD103+DC在肿瘤引流和不引流LN中的水平略有下降，但有显着性差异(补充图5f)，再次表明除了在肿瘤中的作用外，NK细胞在控制CD103+DC水平方面发挥了更广泛的作用。这些结果表明，虽然T细胞和NK细胞都能在肿瘤中产生Flt 31，但T细胞的缺失对肿瘤CD103+DC水平没有影响。而NK细胞产生Flt3l在调控肿瘤中这些保护性DC的水平中起重要作用。

7、TME中NK细胞与SDCs发生频繁而稳定的相互作用

NK细胞是肿瘤中SDC水平所必需的主要淋巴细胞。然而，NK细胞和SDC在肿瘤中非常少见，因此我们提出这样一个问题：NK细胞如何控制肿瘤中的SDC？与其他APC相比，SDC在TME中很少存在，并且很少与传入的T细胞相互作用。相反，当我们对B78黑色素瘤进行活体双光子切片成像时，我们发现NK细胞(Ncr1-GF标记P)经常与SDC密切接触(抗X-C基序趋化因子受体1(XCR 1)的抗体标记；图4a和补充视频1)。对由转染mCherry-OVA融合结构的B78亲本细胞组成的B78-cherryOVA肿瘤14进行活体双光子成像后用于PyMTChOVA小鼠品系，我们发现大约1.9%的NK细胞在Xcr1-Venus+ cDC1的5μm范围内，而只有0.38%的MHCⅠ类限制的卵清蛋白特异性(OT-I)T细胞在Xcr1-Venus+ cDC1的5μm范围内(图4b)。此外，我们还观察到，在XCR 1+cDC 1中，大于5μm的NK细胞迁移(与实质性位移相关的运动)，而与之密切接触的NK细胞(<5μm)的运动能力降低，与连续和/或突触接触一致(图4c和补充视频2)。这些结果表明，在肿瘤中，NK细胞是FLT3L的最相关来源，FLT3L控制着SDC水平，这可能是由于NK细胞对cDC1 DC亲和力增强所致。这一发现与最近在TME 中NK细胞和XCR 1+DC的趋化因子受体配对的研究结果是一致的。与NK细胞直接作用于DC的情况一致，当从WT小鼠LNS中分选CD 103+DC并与NK细胞共培养时，CD103+DC 24h和72h的存活率显著提高(图4d)。这些研究表明，NK细胞比T细胞更能与肿瘤中的SDC形成稳定的相互作用，靶向NK细胞水平可增加FLT3L的产生，进而提高肿瘤中SDC的水平或生存期可能是一种新的治疗手段。应该注意，虽然我们看到有证据表明NK细胞为CD 103+DC在肿瘤中提供了更高的存活率，但NK细胞也可能作用于DC前体以控制这些SDC。

8、人肿瘤中NK细胞丰度与FLT3LG表达及BDCA-3+ SDCs相关

我们的小鼠研究表明，NK细胞产生FLT3L，并控制肿瘤中SDC的水平。根据这些发现，我们通过基于先前发表的数据集和NK细胞特异性基因的表达谱生成NK细胞基因特征来调查人类数据集中NK细胞的丰度(图5a和补充图6)。用NK细胞基因标记对TCGA黑色素瘤样本中NK细胞丰度的估计，我们发现肿瘤中NK细胞的水平与FLT3LG的表达(图5b)有明显的相关性，这与肿瘤内NK细胞是FLT3LG的来源是一致的。与NK细胞基因标签结果一致(图5b)，天然细胞毒性触发受体1的表达(NCR 1)、NK细胞上NK细胞受体基因的特异性表达(补充图6)与FLT3LG在肿瘤中的表达存在显著的个体相关性(补充图7a)。因此，利用SDC(Fig1a)和NK细胞(Fig5a)的基因标记来估计细胞丰度，我们发现黑色素瘤(Fig5c)患者的NK细胞和SDC水平之间存在显著的相关性，这与我们的小鼠数据一致。此外，NCR1、a NK-specific gene的表达与sdc信号有显著的个体相关性。为了直接比较SDC和NK细胞的数量，收集人黑色素瘤活检标本，消化成单细胞悬液，用流式细胞术进行分析(队列A；补充图2和补充表2)。直接分析肿瘤中的NK细胞和SDC，发现肿瘤中NK细胞水平与BDCA-3+DC水平显著相关(图5d)。肿瘤中的BDCA-3+DC与肿瘤中CD4+T辅助细胞(TH)、CD8+T细胞或CD 45-细胞水平无关(补充图7c-e)，提示NK细胞与BDCA-3+DC之间存在特异性的相关性。NK细胞与BDCA-3+DC之间的相关性在其他癌症类型的TME中也被发现，尤其是在头颈部鳞状细胞癌中(HNSCC；图5e)，这表明这种先天免疫细胞关系可能比单一的适应症或亚适应症更广泛。

9、人类黑色素瘤中的NK细胞与整体存活率的提高相关

SDC与NK细胞呈正相关，从逻辑上预测NK细胞数量也能预测生存期。 每个患者中归一化为z评分，根据中位数划分(50%严格度)，NK细胞基因标签(图5A)用于将患者分为NK细胞数“低”或“高”。 这表明，在两个独立数据集的Kaplan-Meier图分析中，NK细胞数高的患者OS显着增加（图6A和补充图 7F)。 在TCGA黑色素瘤数据集中，NCR 1的表达与OS的增加显著相关；此外，NK细胞特征中的5个基因中有4个单独与OS的增加有关（图6b）。 这些发现表明，正如我们在小鼠模型中所显示的那样，在黑色素瘤患者中NK细胞产生FLT3LG，控制肿瘤中BDCA-3+刺激性DC水平，并导致患者生存期增加。 我们注意到这些发现并不排除NK细胞在肿瘤排斥反应中的一个更传统的作用，即直接肿瘤细胞溶解。

10、NK细胞预测黑色素瘤患者对抗PD-1免疫治疗的反应

鉴于NK细胞产生FLT3LG和控制肿瘤中SDC水平，从而预测抗PD-1免疫治疗反应中的重要作用，我们探讨了NK细胞和/或T细胞是否与免疫治疗反应有关。 我们发现抗PD-1免疫治疗的反应性与T调节(Treg)细胞、CD4+Th细胞、CD8+T细胞和PD-1+CTLA-4+T细胞无明显相关性(Fig. 6c)，尽管其中一些群体的趋势较弱。 特别是，我们没有重述以前的数据，表明PD-1+CTLA-4+CD8+“耗尽”的T细胞特征可以预测预后。 然而，NK细胞在抗PD-1免疫治疗后的肿瘤中明显增多(Fig. 6c)。 这些发现与我们在小鼠中的发现一致，即NK细胞、FLT3L和SDC形成了一组影响预后的决定因素，至少在一定程度上可能是由NK通过产生FLT3L而增强SDC所驱动的。

11、NK-SDC轴与抗PD-1免疫治疗的反应性相关

用于黑色素瘤群组A的综合流式细胞仪板对TME中的33个免疫群体进行定量(补充图2和补充表2)。 为了确定TME中的NK细胞和SDC水平是否与抗PD-1免疫治疗的反应性唯一相关，我们在每个样本中对人群分数进行了z评分，发现在TME中已鉴定的免疫细胞中，BDCA-3+DC和NK细胞与抗PD-1免疫治疗的反应性显著相关(图6E和补充表3)。 此外，从这个角度来看，很高频率的HLA-DR-CD4+T细胞似乎与抗PD-1反应密切相关，并可能代表BDCA-3+DC和NK细胞数量不多的患者的另一种预后特征。 这可能表明PD-1阻断可被多种类型的免疫浸润所支持，尽管还需要进一步的研究来证实。