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基因过表达——融合基因过表达

1.导读

此篇文章是建立在之前发表的一篇文章上的,文章标题为:基因克隆有这篇文章就够了

可以关注微信号:bioinfo_cloud 获取,先研究之前的文章!

因为融合基因过表达载体的构建与一般的克隆载体构建流程是一样的,只是在PCR引物设计上有所不同!所以这篇文章只说融合基因过表达引物设计,其他的与文章[基因克隆有这篇文章就够了]描述的相同。

2.融合基因过表达简介

融合表达(fusion expression),指将外源蛋白基因与另一基因的3'端构建成融合基因进行表达,可使克隆化基因表达为融合蛋白的一部分。一般都是带荧光的蛋白,比如EGFP(增强绿色荧光蛋白)。这样在表达出来的蛋白可以通过荧光检测。这在sci文章中很常见!

3.表达载体的选择

表达载体用什么,可参考文献!之前的文章中的案例是用pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体(下图左),其实这个载体也带有绿色荧光标记基因,只不过这个基因和多克隆位点(MCS)并不连续,MCS引入的目的基因由CMV启动子启动,而copGFP基因由EF-α启动子启动,并且EF-α启动子位于这两基因之间,所以一般的克隆载体是不可以用于做融合蛋白的表达的!那么用于融合载体的表达载体是怎样的?如下图右,简单的来说,就是在MCS前或者后有一个标记基因,在启动表达时,这2个蛋白质被一起翻译出来了,也就是一一条肽链,所以称为融合。

这里我们还是以pEGFP-N1和pEGFP-C1载体为例,继续以tnf基因来设计引物!

4.引物设计

同之前的文章一样,找出载体MCS有,而插入基因中无的酶切位点 (以TNF基因为例)这里就不详述了!

我们重点先来看这两个载体MCS区

pEGFP-C1的EGFP基因位于MSC上游,而pEGFP-C1的EGFP基因位于MSC下游。仔细看图,碱基是3个3个的在一起,也就是一个密码子,我们引入基因后不能移码!

下面是分析酶切位点信息,找到了活性高的酶(打钩的)

如果用pEGFP-C1载体,我们选择的酶切位点刚好是像图中红框这样的,比如BglII,刚好是2个正常编码的密码子,这样的引物设计就可以按照克隆引物框架!去掉Kozak序列即可!

当所选酶切位点引起插入序列读框改变时,怎么办?

首先,我们在酶切位点后面先写上TNF基因的序列(如下图),由于EGFP基因在TNF基因的前面,在上游引物设计中,如果选择HindⅢ之间连上TNF基因,那么TNF基因在编码过程中就发发序列移码!为了解决这一问题,我们只需要在TNF基因前补上1-2个碱基,只要后续不引起TNF基因移码即可,置于补的碱基是什么,最简单的是酶切位点后面是什么就补什么。这里补上CG。

对于下游引物和克隆引物一样!

如果用pEGFP-N1载体,EGFP基因位于MSC下游,引物又改如何设计呢?

首先还是找酶切位点!和前面一样一样的!!!

如果选择的酶切位点不会引起移码,上游引物设计和克隆引物设计一样,但值得注意的是,下游引物要去掉终止密码子,原因是因为EGFP基因位于MSC下游,如果加上目的基因的密码子,在转录过程中会中断,这样EGFP蛋白是表达不出来的!!

当所选酶切位点引起EGFP读框改变时,怎么办?

和前面一样,补碱基!

5.总结

总之,融合基因过表达的流程和一般的克隆表达一样!唯一不同的就是引物设计,就是在上游或者下游引物的酶切位点前添加碱基修补读框 (选择酶切位点旁边的碱基就近修补) ,核心思想就是防止移码


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原始发表时间:2019-04-01

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